一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法，属于食品安全技术领域。可视化检测操作步骤如下：（1）制备食物溶液；（2）制备被检测液，将食物溶液与比率荧光探针按比例混合，孵育，得到被检测液；（3）对被检测液检测，通过RGB图像仪测定被检测液在激发波长285nm下避光产生的图像，将图像进行RGB色值的读取，选择以读取的RGB色值中B值与G值之间的比值作为纵坐标，以含菌检测液的菌浓度的对数值作为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程得到相关系数与检出限。本检测方法的线性拟合系数为0.98945，检出限低至6.31CFU/mL。可在食品样品检测现场来快速获取单增李斯特菌的真实浓度。单增李斯特菌的真实浓度。单增李斯特菌的真实浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法


[0001]本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法。

技术介绍

[0002]食源性疾病是一类通过摄取食物使致病因子进入体内而引起感染或中毒的常见人类疾病，其在全球范围内造成严重的公共卫生负担，对经济及社会发展均造成了不利影响。根据世界卫生组织2020年
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2022年数据显示，全世界每年有约5.5亿人
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6亿人因食用受污染的食物而患病，其中约23万人死亡、食源性致病菌是引起食源性疾病的一大原因，其中单增李斯特氏菌是常见致病菌，它广泛存在于环境、食品、人和动物宿主中，可以在极端条件下生存并引起食物污染，食用被该菌污染的食物会引起李斯特菌病，致死率高达20%
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30%，对公共卫生安全危害较大。对于常见致病菌的检测，传统培养方法仍是公认且可靠的方法，但需要经过细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定等多个步骤，较为繁琐；常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法因检测时间较长而受限。而基于免疫学技术的ELISA试剂盒，价格高昂，难以进行工业化大规模推广使用。因此，迫切需要开发简单、快速、高灵敏、精确的策略和分析方法，用于实时检测食品及环境中的单增李斯特菌。新兴的荧光生物探针的检测方法因其成本低、操作简便、响应快、稳定性高等优点，被广泛应用于靶标物质的测定。其中，荧光共振能量转移（FRET)作为一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态，在荧光探针检测技术中被广泛应用。现阶段，作为检测探针的主要荧光标记物包括有机荧光染料、量子点。但是目前使用传统荧光仪器进行检测，其重量大、仪器维修成本高，很难在食品样品现场进行有效检测。
[0003]近年来随着智能检测的快速发展，图像处理技术在有害物浓度检测领域发挥了巨大作用。但目前该技术存在检测模式单一以及需要人为分析等缺点，适用范围相对低，且数据分析难度程度高。

技术实现思路

[0004]针对现有的食品中单增李斯特菌的检测技术存在检测难度大、耗时长的问题，本专利技术提供一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法。
[0005]一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测操作步骤如下：（1）制备食物溶液在被检测食物中接种人工接种单增李斯特菌，制得食物溶液；所述被检测食物为自来水、橙汁、牛奶、熟牛肉、生菜，所述食物溶液为自来水溶液、橙汁溶液、牛奶溶液、熟牛肉溶液、生菜溶液；（2）制备被检测液按照体积1：1将比率荧光探针与步骤（1）得到的食物溶液混合，孵育25min，得到被
检测液；所述比率荧光探针由作为能量供体的第一荧光探针和作为能量受体的第二荧光探针按体积比1：1混合均匀制成；所述第一荧光探针为万古霉素修饰的碳量子点；所述第二荧光探针为适配体修饰的硅纳米颗粒；所述适配体的DNA序列如SEQ ID No:1所示，所述适配体的5
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端用氨基修饰；所述比率荧光探针中，万古霉素修饰的碳量子点的荧光发射波长为458nm，适配体修饰的硅纳米颗粒的荧光发射波长为488nm；（3）对被检测液进行检测将步骤（2）得到的被检测液，通过红绿蓝三色图像仪测定所述被检测液在激发波长285nm下避光产生的图像，将所述图像进行红绿蓝色值的读取；选择以读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值作为纵坐标，并以被检测液的菌浓度的对数值作为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程得到相关系数与检出限；所述自来水的线性拟合系数为0.98211，其检出限为6.31CFU/mL；对于自来水溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.85时，自来水中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.85时，自来水中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到自来水溶液中单增李斯特菌的浓度；所述橙汁的线性拟合系数为0.98090，其检出限为8.51CFU/mL；对于橙汁溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.91时，橙汁中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.91时，橙汁中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到橙汁溶液中单增李斯特菌的浓度；所述牛奶的线性拟合系数为0.98242，其检出限为8.93CFU/mL；对于牛奶溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.90时，牛奶中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.90时，牛奶中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到牛奶溶液中单增李斯特菌的浓度；所述熟牛肉的线性拟合系数为0.98945，其检出限为15.09CFU/mL；对于熟牛肉溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.97时，熟牛肉中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.97时，熟牛肉中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到熟牛肉溶液中单增李斯特菌的浓度；所述生菜的线性拟合系数为0.97770，其检出限为9.60CFU/mL；对于牛奶溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于2.03时，牛奶中未检出单增李斯特菌；所述比值小于2.03时，牛奶中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到牛奶溶液中单增李斯特菌的浓度。
[0006]进一步限定的技术方案如下：步骤（1）中，制备自来水溶液或橙汁溶液或牛奶溶液的操作步骤如下：在1mL的自来水或橙汁或牛奶中人工接种单增李斯特菌，得到单增李斯特菌的终浓度分别为3.9*101CFU/mL、3.9*102CFU/mL、3.9*103CFU/mL、3.9*104CFU/mL、3.9*105CFU/mL、3.9*106CFU/mL、3.9*107CFU/mL的七份溶液；将七份溶液分别在5000
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g条件下离心
5min，弃去上清液；用1mL的磷酸缓冲盐溶液分别对弃去上清液的七份溶液重悬沉淀，得到七份自来水溶液或橙汁溶液或牛奶溶液。
[0007]步骤（1）中，制备熟牛肉溶液或生菜溶液的操作步骤如下：（1.1）在熟牛肉或生菜中接种单增李斯特菌，接种量为3.9*108CFU/g，在室温条件下静置2h，得到接种熟牛肉或接种生菜；（1.2）将接种熟牛肉切成小块或接种生菜切成碎片；（1.3）在灭菌袋中，将25g切成小块的接种熟牛肉或25g切成碎片的接种生菜与25mL 磷酸缓冲盐溶液混合，均质2min，制得磷酸缓冲盐溶液混合液，混合液静置5min，取上清液；通过添加磷酸缓冲盐溶液调整得到上清液中单增李斯特菌的终浓度分别为3.9*101CFU/mL、3.9*102CFU/mL、3.9*103CFU/mL、3.9*104CFU/mL、3.9*105CFU/mL、3.9*106CFU/mL、3.9*107CFU/mL七份溶液，即为七份熟牛肉溶液或七份生菜溶液。
[0008]步骤（2）中，所述比率荧光探针的制备操作如下：（2.1）制备活化混合液按体积比1：1，将浓度10mM的1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法，其特征在于，操作步骤如下：（1）制备食物溶液在被检测食物中接种人工接种单增李斯特菌，制得食物溶液；所述被检测食物为自来水、橙汁、牛奶、熟牛肉、生菜，所述食物溶液为自来水溶液、橙汁溶液、牛奶溶液、熟牛肉溶液、生菜溶液；（2）制备被检测液按照体积1：1将比率荧光探针与步骤（1）得到的食物溶液混合，孵育25min，得到被检测液；所述比率荧光探针由作为能量供体的第一荧光探针和作为能量受体的第二荧光探针按体积比1：1混合均匀制成；所述第一荧光探针为万古霉素修饰的碳量子点；所述第二荧光探针为适配体修饰的硅纳米颗粒；所述适配体的DNA序列如SEQ ID No:1所示，所述适配体的5
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端用氨基修饰；所述比率荧光探针中，万古霉素修饰的碳量子点的荧光发射波长为458nm，适配体修饰的硅纳米颗粒的荧光发射波长为488nm；（3）对被检测液进行检测将步骤（2）得到的被检测液，通过红绿蓝三色图像仪测定所述被检测液在激发波长285nm下避光产生的图像，将所述图像进行红绿蓝色值的读取；选择以读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值作为纵坐标，并以被检测液的菌浓度的对数值作为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程得到相关系数与检出限；所述自来水的线性拟合系数为0.98211，其检出限为6.31CFU/mL；对于自来水溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.85时，自来水中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.85时，自来水中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到自来水溶液中单增李斯特菌的浓度；所述橙汁的线性拟合系数为0.98090，其检出限为8.51CFU/mL；对于橙汁溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.91时，橙汁中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.91时，橙汁中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到橙汁溶液中单增李斯特菌的浓度；所述牛奶的线性拟合系数为0.98242，其检出限为8.93CFU/mL；对于牛奶溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.90时，牛奶中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.90时，牛奶中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到牛奶溶液中单增李斯特菌的浓度；所述熟牛肉的线性拟合系数为0.98945，其检出限为15.09CFU/mL；对于熟牛肉溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于1.97时，熟牛肉中未检出单增李斯特菌；所述比值小于1.97时，熟牛肉中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到熟牛肉溶液中单增李斯特菌的浓度；所述生菜的线性拟合系数为0.97770，其检出限为9.60CFU/mL；对于牛奶溶液，其读取的红绿蓝色值中蓝色值与绿色值之间的比值大于2.03时，牛奶中未检出单增李斯特菌；所
述比值小于2.03时，牛奶中含有单增李斯特菌，将比值带入所述线性回归方程中即可得到牛奶溶液中单增李斯特菌的浓度。2.根据权利要求1所述比率荧光探针对食源性单增李斯特菌的可视化检测方法，其特征在于：步骤（1）中，制备自来水溶液或橙汁溶液或牛奶溶液的操作步骤如下：在1mL的自来水或橙汁或牛奶中人工接种单增李斯特菌，得到单增李斯特菌的终浓度分别为3.9*101CFU/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶应旺，李辉，凌娜，任玉伟，陈韩芳，赵文华，李龙，张丹凤，沈益忠，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：