一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法技术

本发明专利技术公开了以开花后15

【技术实现步骤摘要】
一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法


[0001]本专利技术涉及一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，属于植物基因工程领域。

技术介绍

[0002]植物油是人类和动物的重要营养物质来源。一方面，随着食用植物油需求量的不但增加，耕地面积却不断缩减，这对植物油的产量提出了新的要求和挑战；另一方面，为满足人民对美好生活的需求，食用油的品质也需要进一步改良，提高对人体有利的不饱和脂肪酸含量，降低对人体不利的饱和脂肪酸含量。
[0003]油菜是我国主要的植物性食用油来源。其脂肪酸合成代谢途径已经较为清楚。在质体中，在乙酰
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CoA羧化酶(Accase)和脂肪酸合酶复合体(FAS)的催化作用下，经过一系列多轮的启动、装载、缩合、还原、脱水、再还原过程，最终生成C16:0
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ACP和C18:0
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ACP。其中C18:0
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ACP绝大部分在Δ9硬脂酰
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ACP去饱和酶(Δ9stearoyl
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ACP desaturase，SAD)的作用下迅速脱饱和生成C18:1
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ACP。紧接着C16
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ACP和C18
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ACP在酰基
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ACP硫酯酶的作用下释放出游离脂肪酸，游离脂肪酸在运出叶绿体的过程中需要被活化才能运输到内质网中进行进一步的加工和修饰。
[0004]在脂肪酸从头合成的过程中，FAS中的β
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酮脂酰ACP合酶主要负责缩合反应。β
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酮脂酰ACP合酶有3种，其中第2种β
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酮脂酰ACP合酶(KAS2)，催化棕榈酰ACP(palmitoyl
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ACP，C16
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ACP)与丙二酰ACP之间的聚合反应，产生硬脂酰ACP(stearoyl
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ACP，C18
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ACP)。在拟南芥中，KAS2的纯合缺失突变体是致死的，该基因功能部分丧失会导致棕榈酸(C16:0)含量升高(Carlsson et al.,2002)。在油菜中通过ZFN定点激活内源的KAS2基因，可使油菜种子中C16脂肪酸含量显著降低，C18脂肪酸含量显著增加，同时总的饱和脂肪酸含量降低(Gupta et al.,2012)。Andre等(2012)通过研究发现，甘蓝型油菜种子脂肪酸合成过程中，质体中的18:1
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ACP(18:1
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acyl
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carrier protein)含量积累到一定程度时，便会反馈抑制质体中乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的活性，致使脂肪酸的合成减少。由此可见，过表达KAS2基因能够改变脂肪酸组分，使总的饱和脂肪酸含量降低，提升品质，但同时可能会使质体中的18:1
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ACP(18:1
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acyl
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carrier protein)含量过高，从而抑制ACCase的活性，使脂肪酸的合成减少，降低产量。
[0005]如何有效利用BnKAS2优化脂肪酸组分，同时弥补其过表达对脂肪酸合成带来的负面影响，还未曾有研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，特别是用于拟南芥和油菜，不仅能够弥补BnKAS2单独过表达对脂肪酸合成带来的负面影响，并且使种子中脂肪酸含量显著提高；同时亦进一步降低脂肪酸中C16:0饱和脂肪酸的比例，提高不饱和脂肪酸的比例，提升了脂肪酸品质。
[0007]本专利技术通过下述方案实现：一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，在种子中同时过表达BnKAS2基因和BnLACS9基因。
[0008]一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，通过构建BnKAS2基因和BnLACS9基因共表达载体，构建方法包括以下步骤，
[0009]步骤一、设计引物LH1和LH26，酶切接头分别PmeⅠ和AscⅠ，以PBI121质粒为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆nos终止子序列；
[0010]步骤二、设计引物LH23和LH4，酶切接头分别MluⅠ和PacⅠ，以油菜叶片DNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆napin启动子序列；
[0011]步骤三、使用Pme1和Asc1酶切步骤一中nos终止子PCR扩增片段并回收，使用MluⅠ和PacⅠ酶切步骤二中napin启动子片段扩增产物并回收；
[0012]步骤四、使用PmeⅠ和PacⅠ酶切PMDC83载体并回收载体部分，使用T4连接酶将回收的载体片段与步骤三中nos终止子和napin启动子回收片段进行连接，获得中间载体1；
[0013]步骤五、使用PmeⅠ和PacⅠ酶切步骤四中获得的中间载体1并回收片段部分，使用相同酶酶切P35S:BnLACS9载体回收载体部分，使用T4连接酶将回收的片段部分和载体部分连接，获得中间载体2；
[0014]步骤六、使用引物LH3和LH5，酶切接头分别为PmeⅠ和AscⅠ，以油菜叶片DNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆napin启动子序列；
[0015]步骤七、设计引物LH9和LH10，酶切接头分别为MluⅠ和PmeⅠ，以油菜种子cDNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆BnKAS2基因cDNA序列并连入pEASY
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Blunt载体中；
[0016]步骤八、确定步骤六和步骤七中克隆序列正确性后，使用SpeⅠ和MluⅠ酶切步骤七中克隆载体，回收BnKAS2基因片段部分，使用SpeⅠ和AscⅠ酶切步骤六中克隆载体，回收载体部分，使用T4连接酶将回收的片段部分和载体部分连接，获得中间载体3；
[0017]步骤九、使用PmeⅠ酶切步骤五中获得中间载体2，回收载体部分，使用PmeⅠ酶切步骤八中获得中间载体3，回收片段部分，使用T4连接酶将回收的片段部分和载体部分连接，其对应的载体即为共表达载体PnapA:BnKAS2
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PnapA:BnLACS9。
[0018]所述步骤一中克隆所用PCR程序为：94℃ 2min；94℃ 15s，54℃30s，68℃30s，30cycles。
[0019]所述步骤二中克隆所用PCR程序为：94℃ 2min；94℃ 15s，54℃30s，68℃1min10s，30cycles。
[0020]所述步骤六中克隆所用PCR程序为：94℃ 2min；94℃ 15s，54℃30s，68℃1min10s，30cycles，阳性克隆筛选使用M13F和LH5进行扩增，能扩增出目的条带的即为所需克隆；
[0021]所述步骤七中以开花后15
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20天油菜种子cDNA为模板，阳性克隆筛选使用M13F和LH10进行扩增，能扩增出目的条带的即为所需克隆。
[0022]所述步骤八中SpeⅠ为pEASY
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，其特征在于：在种子中同时过表达BnKAS2基因和BnLACS9基因。2.根据权利要求1所述的一种改良种子脂肪酸组分和提高含油量的方法，其特征在于：通过构建BnKAS2基因和BnLACS9基因共表达载体，构建方法包括以下步骤，步骤一、设计引物LH1和LH26，酶切接头分别PmeⅠ和AscⅠ，以PBI121质粒为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆nos终止子序列；步骤二、设计引物LH23和LH4，酶切接头分别MluⅠ和PacⅠ，以油菜叶片DNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆napin启动子序列；步骤三、使用Pme1和Asc1酶切步骤一中nos终止子PCR扩增片段并回收，使用MluⅠ和PacⅠ酶切步骤二中napin启动子片段扩增产物并回收；步骤四、使用PmeⅠ和PacⅠ酶切PMDC83载体并回收载体部分，使用T4连接酶将回收的载体片段与步骤三中nos终止子和napin启动子回收片段进行连接，获得中间载体1；步骤五、使用PmeⅠ和PacⅠ酶切步骤四中获得的中间载体1并回收片段部分，使用相同酶酶切P35S:BnLACS9载体回收载体部分，使用T4连接酶将回收的片段部分和载体部分连接，获得中间载体2；步骤六、使用引物LH3和LH5，酶切接头分别为PmeⅠ和AscⅠ，以油菜叶片DNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆napin启动子序列；步骤七、设计引物LH9和LH10，酶切接头分别为MluⅠ和PmeⅠ，以油菜种子cDNA为模板，使用KOD高保真DNA聚合酶克隆BnKAS2基因cDNA序列并连入pEASY
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Blunt载体中；步骤八、确定步骤六和步骤七中克隆序列正确性后，使用SpeⅠ和MluⅠ酶切步骤七中克隆载体，回收BnKAS2基因片段部分，使用SpeⅠ和AscⅠ酶切步骤六中克隆载体，回收载体部分，使用T4连接酶将回收的片段部分和载体部分连接，获得中间载体3；步骤九、使用PmeⅠ酶切步骤五中获得中间载体2，回收载体部分，使用PmeⅠ酶切步骤八中获得中间载体3，回收片段部分，使用T4连接酶将回收的...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳寒，程焱，秦源，王路路，李子娴，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：