小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用制造技术

本发明专利技术涉及作物改良技术领域，尤其是一种小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用，其中，TaSPL6B基因的蛋白编码序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术发现TaSPL6B基因在植物调控种子大小过程中发挥了重要作用，可以为改良作物的荚果和种子大小提供新的基因资源，在植物育种方面具有重要应用价值。物育种方面具有重要应用价值。物育种方面具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用


[0001]本专利技术涉及作物改良
，具体领域为小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用。

技术介绍

[0002]种子大小是农作物最重要的农艺性状之一，是决定农作物产量的重要因素。种子过大或过小，都有可能带来产量三要素(亩穗数、穗粒数和粒重)的不协调，会给产量带来不良影响。因此，克隆决定种子大小的相关基因，对植物分子辅助育种、提高作物产量具有重要的现实意义。
[0003]Squamosa promoter binding protein
‑
like(SPL)蛋白是一种植物特异性转录因子，含有高度保守SQUAMOSA PROMOTER
‑
BINDING PROTEIN(SBP)domain结构域，该结构域具有促进下游靶基因转录的共有序列TNCGTACAA，在植物生长发育过程中起重要作用。
[0004]目前，该基因家族在调控分蘖、开花期等方面的研究虽有一些报道，如CN104789574A提供了小麦TaSPL6基因及其应用，通过将TaSPL6基因转化拟南芥，发现该基因能够使拟南芥叶片增大、生物量增加。但是截止目前，在小麦中也还未见到SPL基因参与调控种子大小的相关研究报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用，其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步的，所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0008]其中，所述TaSPL6B基因的蛋白编码序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0009]其中，所述TaSPL6B基因全长gDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]一种TaSPL6B转基因植物的培育方法，具体为：使得如SEQ ID NO：3所示蛋白质在植物中过表达，进而使植物荚果及种子变小。通过向受体植物中导入SEQ ID NO：3所示蛋白质的编码基因，得到转基因植物。
[0011]一种TaSPL6B转基因植物的培育方法：将TaSPL6B的蛋白编码序列连接到pCAMBIA2300
‑
GFP载体中得到重组载体，导入目的植物中，获得TaSPL6B转基因植株。
[0012]具体包括以下步骤：
[0013](1)转化载体的构建
[0014]将TaSPL6B的蛋白编码序列连接到pCAMBIA2300
‑
GFP载体中得到重组载体，将测序验证正确的重组载体命名为pCAMBIA2300
‑
GFP
‑
TaSPL6B；
[0015](2)感受态农杆菌制备及转化
[0016]在LB平板上对农杆菌GV3101菌株划线培养；挑取生长良好的单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡过夜培养后，转移2ml新鲜菌液至50ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡培养至OD
600
值为0.5；将菌液分装到两个50ml离心管中，置冰上预冷30分钟；4℃，4000转/分钟离心10分钟，弃上清，收集菌体；加入10ml预冷的0.15M NaCl溶液，轻轻悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰上预冷30分钟；4℃，4000转/分钟，离心10分钟，弃上清，收集菌体；加入1ml预冷的20mM CaCl2溶液悬浮菌体，200μl分装于1.5ml离心管中，直接用于农杆菌转化或液氮速冻保存于
‑
70℃备用；
[0017]在200μl农杆菌GV3101感受态细胞中加入1μg pCAMBIA2300
‑
GFP
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TaSPL6B重组载体，轻轻混匀，置冰上30分钟；液氮中速冻10分钟，之后于37℃水浴中热激5分钟；加入0.4ml LB液体培养基，28℃，180转/分钟，低速振荡培养2
‑
4小时；然后，将菌液均匀涂布于含有50μg/ml利福平和50μg/ml潮霉素的LB平板培养基上，28℃，暗培养48h；挑取转化后的菌落在平板上划线培养并进行PCR扩增检测；
[0018](3)TaSPL6B转基因拟南芥的获得
[0019]将野生型拟南芥种子进行表面消毒后播种于MS培养基上生长，4℃春化2
‑
3天后，置于温度22℃白天/18℃晚上，光照周期16/8小时，光照强度2500lux的培养箱中生长，12天龄的幼苗移栽至土壤中生长；生长至开花期时，给拟南芥植株充分浇水用于转基因的受体材料；所述土壤中蛭石：营养土为1：1；
[0020]挑取农杆菌阳性克隆于含50μg/ml潮霉素和50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃活化1
‑
2天；按1:100比例接入500ml含50μg/ml潮霉素和50μg/ml利福平LB培养基中，28℃，230转/分钟，振荡培养至OD
600
为0.8
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1.5；室温，4000转/分钟，离心10分钟收集菌体，弃上清，将菌体悬浮于转化缓冲液中；菌体充分悬浮后，将准备好的拟南芥植株剪去已经开放的花，浸入转化缓冲液中5分钟，取出侧放，保湿，暗培养24小时；之后扶正植株，按正常条件培养至种子成熟，收获种子进行转化纯合系的筛选；
[0021](4)纯合系的筛选
[0022]将收获到的转化植株的种子干燥一周后播种于含50μg/ml潮霉素的1/2
×
MS选择培养基上，4℃春化2
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3天，置于温度22℃白天/18℃晚上，光照周期16/8小时，光照强度2500lux的培养箱中生长；当植株生长到6片真叶时，移栽至花盆中继续生长，拟南芥生长状况良好时取少量叶片提取DNA并用PCR检测转基因是否成功，成熟后分单株收获种子T1代；收取的T1代种子分单株同样在含潮霉素选择培养基上生长，分单株收获T2代种子；在T2代观察转基因植株的分离比例，挑取接近3:1的转基因系继续繁殖T3代种子；分单株将T3代种子播种于含潮霉素选择培养基上，从T3代的分离情况来推测T2代中为纯合体植株的单株，并经过PCR分子鉴定后，得到TaSPL6B转基因拟南芥纯合植株。
[0023]其中，鉴定所用引物包括TaSPL6B
‑
F1和TaSPL6B
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R1，序列如SEQ ID NO:8
‑
9所示。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术发现了小麦TaSPL6B基因可用于调控植物荚果及种子大小，TaSPL6B蛋白在植物调控种子大小过程中发挥了重要作用，可以为改良作物的荚果和种子大小提供新的基因资源，在植物育种方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述TaSPL6B基因的蛋白编码序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。2.根据权利要求1所述的小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用，其特征在于：所述双子叶植物具体为拟南芥。3.根据权利要求2所述的小麦TaSPL6B基因在调控植物荚果及种子大小中的应用，其特征在于：所述TaSPL6B基因全长gDNA序列如SEQ ID NO：1所示。4.一种TaSPL6B转基因植物的培育方法，其特征在于：使得如SEQ ID NO：3所示蛋白质在植物中过表达，进而使植物荚果及种子变小。5.根据权利要求4所述的TaSPL6B转基因植物的培育方法，其特征在于：通过向受体植物中导入SEQ ID NO：3所示蛋白质的编码基因，得到转基因植物。6.根据权利要求5所述的TaSPL6B转基因植物的培育方法，其特征在于：将TaSPL6B的蛋白编码序列连接到pCAMBIA2300
‑
GFP载体中得到重组载体，导入目的植物中，获得TaSPL6B转基因植株。7.根据权利要求6所述的TaSPL6B转基因植物的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)转化载体的构建将TaSPL6B的蛋白编码序列连接到pCAMBIA2300
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GFP载体中得到重组载体，将测序验证正确的重组载体命名为pCAMBIA2300
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GFP
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TaSPL6B；(2)感受态农杆菌制备及转化在LB平板上对农杆菌GV3101菌株划线培养；挑取生长良好的单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡过夜培养后，转移2ml新鲜菌液至50ml含50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃，200转/分钟，振荡培养至OD
600
值为0.5；将菌液分装到两个50ml离心管中，置冰上预冷30分钟；4℃，4000转/分钟离心10分钟，弃上清，收集菌体；加入10ml预冷的0.15M NaCl溶液，轻轻悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰上预冷30分钟；4℃，4000转/分钟，离心10分钟，弃上清，收集菌体；加入1ml预冷的20mM CaCl2溶液悬浮菌体，200μl分装于1.5ml离心管中，直接用于农杆菌转化或液氮速冻保存于
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70℃备用；在200μl农杆菌GV3101感受态细胞中加入1μg pCAMBIA2300
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GFP
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TaSPL6B重组载体，轻轻混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘易科，董飞燕，宋婧含，张华东，朱展望，邹娟，佟汉文，陈泠，高春保，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院粮食作物研究所，
类型：发明
国别省市：