一种促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白的制备方法，包括步骤：(1)将GDF

【技术实现步骤摘要】
cartilage from the metaphysis of a calf costochondral junction,the site of initial bone formation[J].BIOMEDICAL REPORTS 14:54,2021.
[0010][4]Shimaoka,H；Dohi,Y；Narikawa,K；et al.Comparison of recombinant growth/differentiation factor
‑
5(rGDF
‑
5)and bone morphogenetic protein
‑
2(rBMP
‑
2)in the in vivo bone formation in porous hydroxyapatite ceramic[J].Key Engineering Materials Vols 284
‑
286(2005)pp 945
‑
948.

技术实现思路

[0011]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种克服现有技术易产生突释、提高GDF
‑
5促成骨分化能力及细胞增殖能力并且还具有骨靶向性的技术。
[0012]为了实现上述目标，本专利技术提供了如下技术方案：
[0013](1)将GDF
‑
5的磷酸盐缓冲液置于N
‑
乙基马来酰亚胺溶液中孵育；经离心后，加入3
‑
(2r/>‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液进孵育；
[0014](2)将帕米磷酸钠溶液于2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液孵育；
[0015](3)将步骤(1)所得物和步骤(2)所得物进行混合进行孵育，即得所述促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白。
[0016]作为本专利技术的优选技术方案，步骤(1)中，所述N
‑
乙基马来酰亚胺溶液为N
‑
乙基马来酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液；所述3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液为3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺溶液。
[0017]作为本专利技术的优选技术方案，所述N
‑
乙基马来酰亚胺溶液中N
‑
乙基马来酰亚胺的浓度为100mM；所述3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液中3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯的浓度为50mM。
[0018]作为本专利技术的优选技术方案，步骤(2)中，所述帕米磷酸钠溶液为帕米磷酸钠的PBS溶液；所述2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液为2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的PBS溶液。
[0019]作为本专利技术的优选技术方案，所述帕米磷酸钠溶液中帕米磷酸钠的浓度为20mM；所述2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液中2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的浓度为100mM。
[0020]作为本专利技术的优选技术方案，步骤(1)中，将GDF
‑
5的磷酸盐缓冲液置于N
‑
乙基马来酰亚胺溶液中孵育30分钟，经离心后，加入3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液进孵育2小时；步骤(2)中，将帕米磷酸钠溶液于2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液孵育2小时；步骤(3)中，所述孵育时间为1小时；进行上述孵育时，孵育温度均为25～35℃。
[0021]作为本专利技术的优选技术方案，步骤(1)中，GDF
‑
5的磷酸盐缓冲液中，GDF
‑
5的浓度为100μg/ml；所述GDF
‑
5的磷酸盐缓冲液与所述N
‑
乙基马来酰亚胺溶液的体积比为1:2。
[0022]作为本专利技术的优选技术方案，步骤(2)中，帕米磷酸钠溶液和2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液的体积相同；步骤(3)中，步骤(1)所得物和步骤(2)所得物的体积相同。
[0023]本专利技术还提供由上述制备方法制备得到的促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白。
[0024]本专利技术还提供上述促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白在制备促进细胞增殖及成骨分化制剂方面的应用。
[0025]为了提高生长因子与支架的结合效率，目前的研究往往采用明胶、壳聚糖及聚乳
酸/乙醇酸共聚物等高分子材料或二氧化硅纳米微球等无机材料为载体，负载生长因子以达到缓释的目的。但其生长因子的释放都不具备骨靶向性，难以控制生长因子在骨组织周围的靶向递送。
[0026]合成具有高矿物亲和力的蛋白是实现骨靶向治疗的关键所在。本专利技术发现，本专利技术所得蛋白相对于GDF
‑
5，与磷酸钙的结合率提升了一倍，表明本专利技术所得蛋白与骨矿物具有良好的骨亲和力，增强了骨靶向性。
[0027]如本专利技术的实施例所示，通过与成骨前体细胞MC3T3
‑
E1共培养发现，相比于GDF
‑
5，本专利技术所得蛋白更有利于促进细胞的增殖、ALP的表达，钙结节生成以及成骨相关基因的表达。这说明，本专利技术所得蛋白不仅增强了GDF
‑
5的骨靶向性，还有利于增强细胞的成骨分化能力。另外，本专利技术所得蛋白能够促进成骨基因ALP，OCN及Runx2的表达，但OPN基因表达情况略低于GDF
‑
5，可能是因为本专利技术蛋白有利于成骨分化快速进入后期，导致其OPN表达量降低。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]1.本专利技术大幅促进了GDF
‑
5促细胞增殖及成骨分化能力；
[0030]2.本专利技术所得的蛋白与骨矿物有更高的亲和力，能在半胱氨酸存在下能实现蛋白的有效释放，从而增强GDF
‑
5的骨靶向性以及在骨组织周围的有效释放；
[0031]3.本专利技术所得的蛋白，还具有优越的生物活性，有望应用于骨组织修复。
附图说明
[0032]图1为帕米膦酸钠，GDF
‑
5和PGDF
‑
5的红外光谱图；
[0033]图2为GDF
‑
5和PGDF
‑
5蛋白位于1600
‑
1700cm
‑1处酰胺I带的峰进行去卷积及二阶导数拟合结果；
[0034]图3为PGDF
‑
5和GDF
‑
5圆二色谱结果；
[0035]图4为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)将GDF
‑
5的磷酸盐缓冲液置于N
‑
乙基马来酰亚胺溶液中孵育；经离心后，加入3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液进孵育；(2)将帕米磷酸钠溶液于2
‑
亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液孵育；(3)将步骤(1)所得物和步骤(2)所得物进行混合进行孵育，即得所述促进细胞增殖及成骨分化的骨靶向性蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述N
‑
乙基马来酰亚胺溶液为N
‑
乙基马来酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液；所述3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液为3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺溶液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述N
‑
乙基马来酰亚胺溶液中N
‑
乙基马来酰亚胺的浓度为100mM；所述3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯溶液中3
‑
(2
‑
吡啶二硫代)丙酸N
‑
琥珀酰亚胺酯的浓度为50mM。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述帕米磷酸钠溶液为帕米磷酸钠的PBS溶液；所述2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖东琴，李立斯，张成栋，潘玉，罗栩伟，
申请(专利权)人：南充市中心医院，
类型：发明
国别省市：