一种小麦籽粒半薄切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦籽粒半薄切片的制备方法，包括以下步骤：(1)取样：采用冰刀片切取小麦颖果中部的样块；(2)固定：采用FAA固定液进行固定；(3)洗涤；(4)脱水：采用不同浓度的乙醇进行逐级脱水；(5)渗透：采用JB

【技术实现步骤摘要】
一种小麦籽粒半薄切片的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种半薄切片的制备方法，尤其涉及一种小麦籽粒半薄切片的制备方法。

技术介绍

[0002]小麦是主要的粮食作物，提高单位面积小麦产量是农业生产的重大目标。小麦籽粒中积累的淀粉和蛋白质的数量被认为是影响小麦产量和品质的主要因素。在籽粒灌浆期，营养物质通过颖果营养转移组织传递到胚乳(Yu Xurun等，2015，Protoplasma 252:605
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617)。小麦颖果腹部维管束是营养物质进入颖果的主要途径，从腹部筛管输出的养分经过韧皮薄壁细胞、木质部薄壁细胞、合点、珠心突起等部位进入胚囊(周竹青等，2003，电子显微学报，(04):292
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297)。切片技术为观察小麦颖果腹沟维管束等营养转移组织形态结构、了解籽粒发育过程中营养物质的运输提供了有利条件。
[0003]目前植物组织切片技术多采用徒手切片法、石蜡切片法和半薄切片法。徒手切片法指用金属刀片将植物组织切成薄片，该方法难以控制样品的切取厚度，易造成切片厚度不均，且不易切取太小、太软和太硬的样品薄片，无法观察小麦胚乳细胞及其内容物质的形态(赵凌霄，2019，扬州大学博士学位论文)。石蜡切片法可以切出薄厚均匀的组织切片，做到连续切片；但该方法一般适用于发育早期的小麦颖果，发育中、后期或成熟期的小麦颖果内贮藏物质增多，不利于观察胚乳细胞的精细结构和淀粉粒形态(刘娟，2022，麦类作物学报，42(01):42
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53；赵凌霄，2019，扬州大学博士学位论文)。半薄切片法所得到的样品切片厚度一般介于超薄切片和石蜡切片厚度之间，在光镜下对组织微细结构的观察效果优于常规石蜡切片，视野比超薄切片广(黄静等，2022，解剖学研究，44(03):269
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270)；该方法可获得灌浆中后期优质的小麦籽粒组织切片(余徐润，2016，扬州大学博士学位论文)。因此，半薄切片法是观察发育中、后期小麦颖果养分运输组织发育的形态和贮藏内容物的一条非常重要的途径。
[0004]目前半薄切片法多采用戊二醛固定液对植物组织固定，包埋液在60
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70℃聚合，聚合时间多为10
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48h(刘大同，2017，麦类作物学报，37(06):739
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749；葛鑫源，2021，南京农业大学学报，44(02):217
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224)，存在着包埋温度要求高不利于观察温度敏感的样品、聚合时间长导致制片周期长的技术问题。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术旨在提供一种包埋温度低、持续时间短和节约制片时间的小麦籽粒半薄切片的制备方法。
[0006]技术方案：本专利技术所述的一种小麦籽粒半薄切片的制备方法包括以下步骤：
[0007](1)取样：采用冰刀片切取小麦颖果中部的样块；
[0008](2)固定：采用FAA固定液进行固定，FAA固定液的组成为：70％乙醇：冰醋酸：福尔马林的体积比＝18:1:1；
[0009](3)洗涤；
[0010](4)脱水：采用不同浓度的乙醇进行逐级脱水；
[0011](5)渗透：采用JB
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4I渗透液和无水乙醇进行逐级渗透；
[0012](6)包埋：采用JB
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4E包埋液进行包埋处理；
[0013](7)切片；
[0014](8)粘片；
[0015](9)染色：采用希夫试剂染色液进行染色。
[0016]进一步地，步骤(1)中，所述小麦颖果为小麦开花后14天、21天和28天的颖果。
[0017]进一步地，步骤(2)中，所述FAA固定液用量为小麦颖果体积的10
‑
20倍，优选为20倍，所述固定的时间为4
‑
24h。
[0018]进一步地，步骤(4)中，所述逐级脱水的程序为：先于70％乙醇静置25
‑
35分钟，再于83％乙醇静置25
‑
35分钟，再于95％乙醇静置25
‑
35分钟，再于100％乙醇静置1
‑
1.5小时，最后更换溶液，于100％乙醇继续静置1
‑
1.5h。
[0019]进一步地，步骤(5)中，所述JB
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4I渗透液的组成为：JB
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4C:JB
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4A＝0.1
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0.2g:10ml，优选为0.1g:10m，所述逐级渗透的程序为：先于50％无水乙醇+50％渗透液静置1
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2天，然后静置于25％无水乙醇+75％渗透液1
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2天，再静置于100％渗透液3
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4天，最后更换渗透液，于100％渗透液继续静置3
‑
4天。
[0020]进一步地，，步骤(6)中，所述JB
‑
4E包埋液的组成为：JB
‑
4I与JB
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4C的体积比＝24
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26:1，优选为25:1。
[0021]进一步地，步骤(9)中，所述希夫试剂的制备方法为：取0.1g碱式品红溶于60
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70ml热去离子水，放冷至室温后过滤；加10
‑
12ml偏重亚硫酸钠溶液和2
‑
4ml盐酸，充分搅拌后用水稀释至100ml，放置，放入0.2
‑
0.4g活性炭充分震摇后得无色溶液，将无色溶液转移至棕色瓶中保存，即得希夫试剂；具体地：取0.1g碱式品红溶于60ml热去离子水，放冷至室温后过滤；加10ml偏重亚硫酸钠溶液和2ml盐酸，充分搅拌后用水稀释至100ml，放置，放入0.2g活性炭充分震摇2min后得无色溶液。
[0022]进一步地，步骤(9)中，所述热去离子水的温度为70
‑
80℃，偏重亚硫酸钠溶液的浓度为1
‑
1.2g/ml，优选为1g/ml，盐酸的浓度为37％。
[0023]专利技术原理：JB
‑
4是一种水溶性，基于GMA的塑料树脂试剂盒，旨在用于制备用于高分辨率光学显微镜的包埋样品。已催化单体还能起到干燥和渗透中介的作用，因此样本使用100％乙醇干燥脱水是不必要的(但体大致密的组织还是推荐使用乙醇)；JB
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4不需要二甲苯和氯仿等清洗剂。
[0024]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：本专利技术提供了一套新的适用于小麦籽粒的半薄切片的固定包埋技术，采用FAA固定液固定小麦颖果，JB
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4E包埋液对小麦颖果进行包埋，包埋时聚合过程较为温和，温度较低，有利于观察温敏感样本，包埋持续时间大幅缩短，节约制片时间；JB
‑
4E包埋的样本和石蜡包埋的样本相比，在皱缩和形态改变上都有很大的改善，半薄切片图像清晰，视野大于超薄切片，有利于获得高质量的光镜图像，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小麦籽粒半薄切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取样：采用冰刀片切取小麦颖果中部的样块；(2)固定：采用FAA固定液进行固定，FAA固定液的组成为：70％乙醇：冰醋酸：福尔马林的体积比＝18:1:1；(3)洗涤；(4)脱水：采用不同浓度的乙醇进行逐级脱水；(5)渗透：采用JB
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4I渗透液和无水乙醇进行逐级渗透；(6)包埋：采用JB
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4E包埋液进行包埋处理；(7)切片；(8)粘片；(9)染色：采用希夫试剂染色液进行染色。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述小麦颖果为小麦开花后14天、21天和28天的颖果。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述FAA固定液用量为小麦颖果体积的10
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20倍。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定的时间为4
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24h。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述逐级脱水的程序为：先于70％乙醇静置25
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35分钟，再于83％乙醇静置25
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35分钟，再于95％乙醇静置25
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35分钟，再于100％乙醇静置1
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1.5小时，最后更换溶液，于100％乙醇继续静置1
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1.5h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述JB
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4I渗透液的组成为：JB
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑雪娇，杨宝林，王媛花，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：