一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途，属于生物技术领域。本发明专利技术通过噬菌体展示技术，将新型冠状病毒受体结合区蛋白作为靶分子对噬菌体展示十二肽库进行筛选，获取一种靶向新型冠状病毒受体结合区蛋白的噬菌体多肽，其氨基酸序列为：SerValTyrAsnAlaLeuTyrLeuAsnAlaAlaGlu。上述多肽与新型冠状病毒受体结合区蛋白具有较好的结合性能和特异性。本发明专利技术所述多肽可应用于新型冠状病毒分析检测、多肽药物的开发、新型冠状病毒的捕获与释放等领域，为新型冠状病毒的免疫分析与治疗药物提供了元件。病毒的免疫分析与治疗药物提供了元件。病毒的免疫分析与治疗药物提供了元件。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种与新冠受体结合区蛋白结合的噬菌体多肽。
技术背景
[0002]由新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)引发的疾病可通过人群或环境介质传播，具有极高的致病性和传染性，成为人类史上面临最严峻的挑战之一，对人民生命健康、公共卫生体系和经济发展造成巨大威胁。
[0003]新型冠状病毒(SARS
‑
COV
‑
2)，颗粒呈圆或椭圆型，直径60
‑
140nm，β冠状病毒属，包括非结构蛋白(orf 1\ab编码)与结构蛋白(N：核衣壳蛋白、S：刺突糖蛋白、E：包膜蛋白、M：膜蛋白)。SARS
‑
COV
‑
2进入宿主过程中，刺突糖蛋白上的受体结合区(Receptor
‑
Binding Domain，RBD，319aa
‑
541aa)蛋白有着至关重要的作用，是病毒进入宿主的桥梁，因此，RBD蛋白通常被当作为优良的检测与治疗靶点。新型冠状RBD单克隆抗体常作为新型冠状病毒的检测元件或治疗药物，如专利“一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用”(申请号：CN202010151348.6)公开了一种可应用于新型冠状病毒诊断、预防和治疗的新型冠状RBD蛋白单抗，但单抗具有的制备成本高、周期长、需要专业的操作人员、消耗抗原、批间差异大等缺点，故寻找其替代元件是十分必要的。<br/>[0004]噬菌体展示技术于1985年由Smith专利技术，于2018年荣获诺贝尔化学奖，该技术原理是将外源基因(编码多肽或蛋白质)片段插入丝状噬菌体外壳蛋白基因，外源基因会随外壳蛋白的表达展示在噬菌体的表面，保持独立生物活性和空间构象，以利于靶蛋白的识别与结合。将噬菌体随机展示肽库投入包被有靶物质的固相载体上，投入肽库经过一段时间孵育后，洗去未结合或亲和力弱的噬菌体，以竞争洗脱或酸洗脱方式获取结合噬菌体，按此步骤进行3
‑
5轮筛选，得到可结合目标特性目标的噬菌体。该技术自第一次报道以来，已被广泛应用于单克隆抗体、大分子蛋白质、小分子、酶等物质的筛选。噬菌体展示多肽具有制备成本低、时间短、批间差异小等优点，是单克隆抗体、毒素抗原等物质的优良替代品。

技术实现思路

[0005]针对传统单抗的不足，本专利技术的目的是提供与新型冠状受体结合区蛋白特异性结合噬菌体多肽，以期作为传统RBD单克隆抗体的替代品，应用于新型冠状的检测与治疗。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实施：
[0007](1)将购买的新型冠状RBD蛋白包被于酶标孔，3
‑
5％脱脂奶粉封闭两小时，加入噬菌体展示随机十二肽库，适用PBST吸取不结合或结合力弱的噬菌体，酸洗脱靶标噬菌体，再将洗脱的噬菌体扩增至一定滴度作为下一轮筛选的肽库。按照“吸附
‑
洗涤
‑
洗脱
‑
扩增”步骤进行了三轮筛选，在筛选的过程中，改变PBST的浓度、噬菌体孵育时间、酸洗脱时间等条件，使得筛选条件变得逐渐苛刻，以便筛选到亲和力及特异性更强的噬菌体。
[0008](2)在经过三轮筛选之后，挑取了46个单克隆噬菌体进行phage
‑
ELISA的初步鉴定，将能够于新型冠状受体结合区蛋白结合的噬菌体，使用牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、麦芽糖蛋白、人可溶性生长刺激表达蛋白、抗伏马毒素纳米抗体、人脂联素蛋白作为阴性对照，PBS作为空白对照，获取两个与受体结合区蛋白特异性结合的噬菌体，将这两个噬菌体进行扩增、质粒提取、测序，发现其中一个噬菌体的插入多肽链丢失，另一噬菌体插入多肽序列为S
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V
‑
Y
‑
N
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A
‑
L
‑
Y
‑
L
‑
N
‑
A
‑
A
‑
S
‑
E，所述多肽为12个氨基酸组成，插入在噬菌体的外壳蛋白基因上。
[0009]本专利技术的噬菌体展示多肽可特异性与新型冠状受体结合区蛋白结合，作为传统RBD单抗的替代元件，应用于新型冠状的检测与治疗。
[0010]本专利技术具有以下益处：
[0011](1)与传统的单抗相比，本专利技术的噬菌体展示多肽具有操作简单、成本较低、易于制备、易于修饰、生物安全性高等优点。
[0012](2)本专利技术多肽序列是国内外首次报道，具有较高的创新性。
[0013](3)本专利技术提供的噬菌体展示多肽可应用于新型冠状病毒的免疫分析或治疗所用的探针或试剂盒等产品。
附图说明
[0014]图1是挑选46个噬菌体克隆，通过Phage
‑
ELISA验证阳性克隆的结果；横坐标为噬菌体克隆的编号，纵坐标为450nm处吸光值；
[0015]图2通过Phage
‑
ELISA验证3
‑
22噬菌体特异性的结果；横坐标为于酶标板包被的蛋白类型；纵坐标为450nm处吸光值。
具体实施方式
[0016]本专利技术实施例中所用材料、所用试剂及配方如下：
[0017]主要实验材料：
[0018]新型冠状病毒受体结合区蛋白(宁波迈跃)，噬菌体随机展示十二肽库、E.coil ER2738由南昌大学中德联合研究院食品质量与安全实验室保存。
[0019]主要试剂：
[0020]HRP(辣根过氧化物)酶
‑
抗噬菌体单克隆抗体(北京义翘神州科技有限公司)，Tween
‑
20(北京索莱宝科技有限公司)，鸡卵清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司)，牛卵清白蛋白(美国sigma公司)，脱脂奶粉(上海生工生物有限公司)，四甲基联苯胺(上海生工生物科技有限公司)，异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(上海生工生物科技有限公司)，5
‑
溴
‑
4氯
‑3‑
吲哚
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷(天根生化科技有限公司)，四环素(北京索莱宝科技有限公司)，PEG8000(北京索莱宝科技有限公司)，LB肉汤(青岛海博生物科技有限公司)
[0021]主要试剂配方：
[0022]1、LB液体培养基：称取25g LB肉汤溶解于1000mL超纯水中，121℃高压灭菌15min；
[0023]2、LB/IPTG/X
‑
gal平板：LB固体培养基，高压灭菌，加入1％IPTG/X
‑
gal混匀，每个灭菌平板中倒入25mL，冷却后4℃封口避光贮存；
[0024]3、顶层琼脂：LB液体培养基，1g/LMgCl2·
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，由12个氨基酸组成，与新型冠状病毒受体结合区RBD蛋白有着较好的结合性能及特异性。3.根据权利要求1或2所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽，其特征在于，通过GGGSS连接在M13噬菌体外壳蛋白上。4.权利要求1
‑
3任一项所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)将新型冠状RBD蛋白作为筛选靶标，投入噬菌体展示12肽库进行三轮固相筛选。(2)随机挑取三轮筛选后的单克隆噬菌斑扩增。(3)Phage
‑
ELISA鉴定与RBD蛋白的结合能力及特异性，将靶向结合新型冠状RBD蛋白的噬菌斑测序。5.根据权利要求4所述的靶向结合新型冠状病毒受体结合区的噬菌体多肽的制备方法，其特征在于，第一轮筛选扩增步骤为：(1)将96孔酶标板用无菌超纯水润湿后，置于超净工作台中，紫外光线下照射半小时杀菌；(2)取100μL浓度为50μg/mL RBD蛋白至紫外灭菌后的酶标板中，4℃冷藏柜中包被过夜；(3)在无菌操作台中，用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，然后加入250
‑
350μL经过滤除菌的1
‑
3％BSA
‑
TBS封闭液，37℃恒温箱中封闭1
‑
2h；(4)用无菌0.1％TBST洗涤液清洗三次，每次均在无菌纸上拍干，取十二肽库(2
×
10
11
pfu/孔)，加入100μL无菌1
×
TBS，混匀后加入上述酶标板中，37℃结合1h；(5)0.1％TBST清洗三次，加入100μL Gly
‑
HCl洗脱缓冲液，37℃摇床匀速振荡洗脱8
‑
15min，吸出洗脱产物，迅速加入预先调试好的适当体积的Tris
‑
HCl中和缓冲液至中性；(6)取10
‑
15μL用于噬菌体滴度的测定，剩余全部用于噬菌体的扩增；(7)在LB/Tet固体培养基平板上划线接种E.coli...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗义，胡文进，毛大庆，袁青彬，蔺怀，刘奕辰，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：