功能分子修饰的单域抗体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，包括如下步骤：于固定化酶作用下，抗体和功能分子进行偶联反应，分离所得反应体系中的所述固定化酶和清液，收集所述清液，制备功能分子修饰的抗体；所述抗体为单域抗体或者其衍生物；所述固定化酶包括固定载体以及固定在所述固定载体上的酶。该制备方法能够实现固定化酶的重复利用，在实际生产中能够有效降低成本，创造更高经济效益。并且，采用该方法对单域抗体或其衍生物进行功能化修饰，能极大简化蛋白纯化步骤，有效避免酶污染，为单域抗体或其衍生物探针的临床应用和工业化制备提供了可行方案。备提供了可行方案。备提供了可行方案。

【技术实现步骤摘要】
功能分子修饰的单域抗体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及酶工程和抗体修饰
，特别是涉及一种功能分子修饰的单域抗体及其制备方法。

技术介绍

[0002]癌症是全球最大的健康问题之一，其致死率高居第二位，仅次于心脑血管疾病。现有影像学技术以及治疗手段仍不能满足肿瘤早筛以及精准治疗的目的，大多数癌症患者被发现时已是晚期，治疗预后差，生存中位期短，且需面临化疗、放疗等带来的严重副作用，因此，精准诊疗成为迫切需求。
[0003]抗体作为一种具有靶向能力的蛋白质分子，能够有效识别肿瘤细胞中特异性或高表达的靶点，并与之结合，是一类能够满足癌症临床诊断和治疗，以及生命科学研究的非常有潜力的生物工具，具有重大的临床应用价值和基础研究意义。
[0004]其中，单域抗体(Single domain antibody，sdAb)是一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失轻链和重链恒定区的抗体，是目前已知可以结合目标抗原的最小单位，分子量仅有15kDa左右，尺寸不足4nm，因此又被称为纳米抗体(Nanobody，Nb)。
[0005]相比传统单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)，单域抗体具有分子量小、理化性质稳定、体内循环时间短、清除速度快、穿透深度深、亲和力高、体内免疫反应性低，以及易于表达重组等优点。因此，相较于传统抗体，单域抗体在细胞/活体成像、癌症早筛以及药物递送等方面更具临床转化前景和研究价值。然而，目前还未有适用于临床应用和工业化的功能化单域抗体或其衍生物的制备方法。

技术实现思路

[0006]基于此，本申请实施例的目的包括提供一种功能分子修饰的单域抗体的制备方法。
[0007]在本申请的第一方面，提供一种基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]于固定化酶作用下，抗体和功能分子进行偶联反应，分离所得反应体系中的所述固定化酶和清液，收集所述清液，制备功能分子修饰的抗体；
[0009]所述抗体为单域抗体或者其衍生物；
[0010]所述固定化酶包括固定载体以及固定在所述固定载体上的酶。
[0011]在本申请的一些实施方式中，所述方法满足如下(I)至(VI)所示条件中的一个或者多个：
[0012](I)所述酶包括谷氨酰胺转氨酶和转肽酶中的一种或者多种；
[0013](II)所述固定载体的材质包括天然有机聚合物、合成有机聚合物、无机金属、无机金属氧化物、硅和硅氧化物中的一种或者多种；
[0014](III)所述固定载体呈球状；
[0015](IV)固定的方式包括共价结合、吸附、交联和二硫键连接中的一种或者多种；
[0016](V)分离的方式包括磁分离、离心、过筛和色谱分离中的一种或者多种；以及，
[0017](VI)所述功能分子包括荧光染料、药物、造影剂、桥联分子、聚乙二醇、糖类、脂类、核酸、蛋白质、肽、肽类似物和金属螯合剂中的一种或者多种。
[0018]在本申请的一些实施方式中，所述方法还包括在从所述反应体系中分离出固定化酶后对其进行清洗的步骤。
[0019]在本申请的一些实施方式中，所述单域抗体或者其衍生物的C端表达LLQS序列片段，所述单域抗体包括抗CD47单域抗体、抗CD38单域抗体和抗GPC3单域抗体中的一种或者多种，所述酶为谷氨酰胺转氨酶，所述固定载体的材质为四氧化三铁，固定的方式为共价结合，分离的方式为磁分离。
[0020]在本申请的一些实施方式中，偶联反应满足如下(1)至(6)所示条件中的一个或者多个：
[0021](1)每0.1mg
‑
0.5mg所述抗体对应使用10倍
‑
50倍摩尔当量的所述功能分子；
[0022](2)反应温度为20℃
‑
37℃；
[0023](3)反应的pH值为7.5
‑
8.5；
[0024](4)反应的时间为12h
‑
24h；
[0025](5)反应于含有0.08wt％
‑
0.12wt％的聚乙二醇的Tris
‑
NaCl缓冲液环境中进行；可选地，所述聚乙二醇的分子质量为3000g/mol
‑
4000g/mol；以及，
[0026](6)反应在振荡或者旋转条件下进行。
[0027]在本申请的一些实施方式中，所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：
[0028]N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑
N
’‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和表面修饰羧基的固定载体进行第一阶段反应，固液分离，弃上清，制备第一反应物；以及，
[0029]所述第一反应物和所述酶进行第二阶段反应，固液分离，弃上清，制备固定化酶。
[0030]在本申请的一些实施方式中，第一阶段反应满足如下(A)至(E)所示条件中的一个或者多个：
[0031](A)所述的N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑
N
’‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和表面修饰羧基的所述固定载体的质量比为(0.8
‑
1.2)：(0.8
‑
1.2)：10；
[0032](B)反应时间为30min
‑
60min；
[0033](C)反应于MES缓冲液1中进行；可选地，所述MES缓冲液1的浓度为0.01M
‑
0.02M，pH值为5.5
‑
6.0；
[0034](D)反应温度为20℃
‑
37℃；以及，
[0035](E)反应在振荡或者旋转条件下进行。
[0036]在本申请的一些实施方式中，第二阶段反应满足如下A)至E)所示条件中的一个或者多个：
[0037]A)所述固定载体和所述谷氨酰胺转氨酶的质量比为10：(10
‑
15)；
[0038]B)反应时间为4h
‑
6h；
[0039]C)反应于MES缓冲液2中进行；可选地，所述MES缓冲液2的浓度为0.01M
‑
0.02M，pH值为5.5
‑
6.0；
[0040]D)反应温度为20℃
‑
37℃；以及，
[0041]E)反应在振荡或者旋转条件下进行。
[0042]在本申请的一些实施方式中，所述固定载体的直径为100nm
‑
2μm；或/和，固液分离的方式为磁分离。
[0043]在本申请的一些实施方式中，所述固定化酶的制备方法还包括如下步骤：
[0044]采用包含聚乙二醇的PBS缓冲液对所述固定化酶进行第一阶段洗涤；以及，
[0045]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：于固定化酶作用下，抗体和功能分子进行偶联反应，分离所得反应体系中的所述固定化酶和清液，收集所述清液，制备功能分子修饰的抗体；所述抗体为单域抗体或者其衍生物；所述固定化酶包括固定载体以及固定在所述固定载体上的酶。2.根据权利要求1所述的基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，所述方法满足如下(I)至(VI)所示条件中的一个或者多个：(I)所述酶包括谷氨酰胺转氨酶和转肽酶中的一种或者多种；(II)所述固定载体的材质包括天然有机聚合物、合成有机聚合物、无机金属、无机金属氧化物、硅和硅氧化物中的一种或者多种；(III)所述固定载体呈球状；(IV)固定的方式包括共价结合、吸附、交联和二硫键连接中的一种或者多种；(V)分离的方式包括磁分离、离心、过筛和色谱分离中的一种或者多种；以及，(VI)所述功能分子包括荧光染料、药物、造影剂、桥联分子、聚乙二醇、糖类、脂类、核酸、蛋白质、肽、肽类似物和金属螯合剂中的一种或者多种；可选地，所述方法还包括在从所述反应体系中分离出固定化酶后对其进行清洗的步骤。3.根据权利要求1或者2所述的基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，所述单域抗体或者其衍生物的C端表达LLQS序列片段，所述单域抗体包括抗CD47单域抗体、抗CD38单域抗体和抗GPC3单域抗体中的一种或者多种，所述酶为谷氨酰胺转氨酶，所述固定载体的材质为四氧化三铁，固定的方式为共价结合，分离的方式为磁分离。4.根据权利要求3所述的基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，偶联反应满足如下(1)至(6)所示条件中的一个或者多个：(1)每0.1mg
‑
0.5mg所述抗体对应使用10倍
‑
50倍摩尔当量的所述功能分子；(2)反应温度为20℃
‑
37℃；(3)反应的pH值为7.5
‑
8.5；(4)反应的时间为12h
‑
24h；(5)反应于含有0.08wt％
‑
0.12wt％的聚乙二醇的Tris
‑
NaCl缓冲液环境中进行；可选地，所述聚乙二醇的分子质量为3000g/mol
‑
4000g/mol；以及，(6)反应在振荡或者旋转条件下进行。5.根据权利要求3所述的基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑
N
’‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和表面修饰羧基的固定载体进行第一阶段反应，固液分离，弃上清，制备第一反应物；以及，所述第一反应物和所述酶进行第二阶段反应，固液分离，弃上清，制备固定化酶。6.根据权利要求5所述的基于固定化酶的功能分子修饰抗体的方法，其特征在于，第一阶段反应满足如下(A)至(E)所示条件中的一个或者多个：(A)所述的N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑
N
’‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和表面
修饰羧基的所述固定载体的质量比为(0.8
‑
1.2)：(0.8
‑
1.2)：10；(B)反应时间为30min
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：吴长锋，张博，周思妤，刘莹，吕嘉晖，曾逸祺，杨毅诚，房晓峰，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：