一种干细胞外泌体提取试剂盒以及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞外泌体提取试剂盒，所述试剂盒包括：沉淀剂PEG、PDDA包覆PS微球、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液。本发明专利技术还公开了使用该试剂盒对干细胞外泌体进行提取的方法。本发明专利技术提取干细胞外泌体具有成本低、操作简单且纯度高的特点，适合大规模应用。适合大规模应用。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体提取试剂盒以及提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种干细胞外泌体提取试剂盒以及提取方法。

技术介绍

[0002]干细胞外泌体是一类由干细胞分泌的具有完整膜结构的细胞外囊泡，包含多种脂质、蛋白质、RNA等生物活性因子，直径约为30～150nm。干细胞外泌体具有与干细胞相似的生物学性能，但是与干细胞相比，外泌体的免疫原性更低，也更为安全、稳定高效，在现代生物学和医学领域具有很高的开发应用潜力。
[0003]目前，干细胞外泌体主要是从培养干细胞所收获的培养液中提取得到。干细胞外泌体的提取方法主要包括超速离心法、磁珠抗体捕获法、聚合物沉淀法、色谱排阻法、超滤法等。这些方法都存在一定的缺陷，超速离心法、色谱排阻法对设备的要求高，磁珠抗体捕获法试剂价格昂贵，不适用于大量样品处理，聚合物沉淀法纯度低，超滤法对超滤膜的寿命降低，且外泌体产量低。因此，需要开发成本低、操作简单且纯度高的外泌体提取方法。

技术实现思路

[0004]基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种干细胞外泌体提取试剂盒以及提取方法。
[0005]本专利技术提出的一种干细胞外泌体提取试剂盒，所述试剂盒包括：
[0006]沉淀剂PEG、PDDA包覆PS微球、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液；
[0007]所述第一缓冲液含0.1～0.5M的NaCl和20～100mM的PBS，pH为7.4；
[0008]所述第二缓冲液为10～20mM的PBS缓冲液，pH为7.4；r/>[0009]所述第三缓冲液含0.3～0.5M的NaCl和50～100mM的PBS，pH为6.5。
[0010]优选地，所述PDDA包覆PS微球的制备方法包括：将PDDA加入羧基化PS微球的水分散液中，先超声分散10～15min，然后搅拌1～2h，然后离心，将得到的沉淀物冷冻干燥，即得。
[0011]其中，羧基化PS微球可以通过市售购买得到，或者通过常规制备方法制备得到。
[0012]优选地，所述PDDA与羧基化PS微球的质量比为(2～5)：1；所述羧基化PS微球的粒径为1～25μm。
[0013]优选地，所述羧基化PS微球的水分散液的固含量为1～5％。
[0014]优选地，所述沉淀剂PEG为分子量为6000～15000的PEG。
[0015]一种干细胞外泌体的提取方法，使用所述的试剂盒；所述提取方法包括下述步骤：
[0016]S1、将干细胞培养液经过低速离心处理，得到上清液；
[0017]S2、将沉淀剂PEG加入第一缓冲液中，得到沉淀试剂；将3～5mL S1得到的上清液与2～3mL所述沉淀试剂混合均匀后，在0～4℃下孵育6～12h，然后于15000～18000g下离心10～15min，得到沉淀物；
[0018]S3、将S2得到的沉淀物在50～200μL第二缓冲液中重悬，得到样品溶液；将10～15mg PDDA包覆PS微球在10～20mL第二缓冲液中重悬，得到微球悬液；将所述样品溶液与微球悬液混合均匀后，在0～4℃下孵育2～3h，然后于10000～15000g下离心20～30min，得到沉淀物；
[0019]S4、将S3得到的沉淀物在第三缓冲液中重悬后，在0～4℃下孵育0.5～1h，然后于10000～15000g下离心20～30min，弃去沉淀，得到外泌体溶液。
[0020]优选地，S1中，低速离心处理的具体步骤包括：先于300～500g下离心10～15min，去除沉淀物，然后于2000～3000g下离心10～15min，去除沉淀物，再于8000～10000g下离心30～40min，去除沉淀物，即可。
[0021]优选地，所述沉淀试剂中，沉淀剂PEG的浓度为80～150mg/mL。
[0022]本专利技术的有益效果如下：
[0023]本专利技术先以沉淀剂PEG对干细胞上清液进行沉淀处理，得到含外泌体的沉淀物，再采用表面带正电荷的PDDA(聚二烯丙基二甲基氯化铵)包覆PS微球，在pH适宜的缓冲液中通过静电吸附使外泌体吸附在微球表面，经过离心分离去除一部分杂质和杂蛋白，然后再通过pH和离子强度的调整，使外泌体从微球表面脱落，分散在缓冲液中，而一部分杂蛋白仍然吸附在微球表面，从而经过离心分离进一步去除杂质，得到纯化后的外泌体溶液。本专利技术的外泌体提取方法通过聚合物沉淀法与静电吸附法结合，能够更好地去除外泌体中的杂质和蛋白碎片，具有成本低、操作简单且收获的外泌体纯度高的特点，适合大规模应用。
具体实施方式
[0024]下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。
[0025]下述实施例和对比例中，所使用的的干细胞培养液制备方法如下：
[0026]将脐带清洗干净后，剔除血管，剪碎后加入0.1％I型胶原酶，于37℃下消化12h，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用筛网过滤除去组织块后离心，弃去上清液，将沉淀物用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞融合度为80％以上时进行传代，待传代至P3代时，取P3代干细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养至细胞融合度为80％以上，更换为新鲜无血清DMEM培养基，继续培养48h，得到脐带间充质干细胞培养液。
[0027]实施例1
[0028]一种干细胞外泌体的提取方法，包括下述步骤：
[0029]S1、将干细胞培养液先于300g下离心10min，去除沉淀物，然后于2000g下离心10min，去除沉淀物，再于8000g下离心30min，去除沉淀物，得到上清液；
[0030]S2、将分子量为6000的PEG加入第一缓冲液中，得到浓度为80mg/mL的沉淀试剂；将3mL S1得到的上清液与2mL所述沉淀试剂混合均匀后，在4℃下孵育6h，然后于15000g下离心10min，得到沉淀物；
[0031]第一缓冲液含0.1M的NaCl和20mM的PBS，pH为7.4；
[0032]S3、将S2得到的沉淀物在50μL第二缓冲液中重悬，得到样品溶液；将10mg PDDA包覆PS微球在10mL第二缓冲液中重悬，得到微球悬液；将所述样品溶液与微球悬液混合均匀后，在4℃下孵育2h，然后于10000g下离心20min，得到沉淀物；
[0033]第二缓冲液为10mM的PBS缓冲液，pH为7.4；
[0034]PDDA包覆PS微球的制备方法包括：将PDDA加入固含量为1％的羧基化PS微球的水分散液中，先超声分散10min，然后搅拌1h，然后离心，将得到的沉淀物冷冻干燥，即得；其中PDDA与羧基化PS微球的质量比为2：1，羧基化PS微球的粒径为1μm；
[0035]S4、将S3得到的沉淀物在100μL第三缓冲液中重悬后，在4℃下孵育0.5h，然后于10000g下离心20min，弃去沉淀，得到外泌体溶液；
[0036]第三缓冲液含0.3M的NaCl和50mM的PBS，pH为6.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：沉淀剂PEG、PDDA包覆PS微球、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液；所述第一缓冲液含0.1～0.5M的NaCl和20～100mM的PBS，pH为7.4；所述第二缓冲液为10～20mM的PBS缓冲液，pH为7.4；所述第三缓冲液含0.3～0.5M的NaCl和50
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100mM的PBS，pH为6.5。2.根据权利要求1所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述PDDA包覆PS微球的制备方法包括：将PDDA加入羧基化PS微球的水分散液中，先超声分散10～15min，然后搅拌1～2h，然后离心，将得到的沉淀物冷冻干燥，即得。3.根据权利要求1所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述PDDA与羧基化PS微球的质量比为(2～5)：1；所述羧基化PS微球的粒径为1～25μm。4.根据权利要求1所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述羧基化PS微球的水分散液的固含量为1～5％。5.根据权利要求1所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于，所述沉淀剂PEG为分子量为6000～15000的PEG。6.一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，使用权利要求1～5任一项所述的试剂盒；所述提取方法包括下述步骤：S1、将干...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琴，高傲杰，丁丁，
申请(专利权)人：安徽国科门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：