一种新城疫病毒双质粒拯救系统及其构建方法、鉴定方法与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种新城疫病毒双质粒拯救系统及其构建方法、鉴定方法与应用，先基于CMV启动子构建新城疫病毒LaSota株全基因组cDNA克隆质粒，然后构建可同时表达NP、P、L蛋白的多启动子单辅助质粒pCI

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫病毒双质粒拯救系统及其构建方法、鉴定方法与应用


[0001]本专利技术涉及RNA病毒反向遗传学
，尤其涉及一种新城疫病毒双质粒拯救系统、鉴定方法及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]RNA病毒反向遗传学(Reverse genetics)，是通过构建病毒全基因组cDNA分子克隆，在DNA水平上对RNA病毒进行人工定向操作与修饰，然后通过体外转录的方法获得具有感染性的子代病毒的方法。
[0003]新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为副黏病毒科禽腮腺炎病毒亚科正禽腮腺炎病毒属不分节段的负链RNA病毒，宿主范围几乎遍及所有鸟类，强毒株可以引起整个循环系统和中枢神经系统损害，对养殖业危害严重。新城疫病毒弱毒苗作为病毒疫苗载体有极为显著的优点，比如：安全性高，遗传稳定，不与宿主基因整合，给药方便等。基于反向遗传操作技术病毒拯救系统的建立是实现病毒人工改造的物质基础。
[0004]自从1999年，第一株新城疫病毒拯救成功至今，新城疫病毒拯救系统经历了多次完善，从最初需要预先感染表达T7 RNA聚合酶的痘病毒或构建稳定表达T7聚合酶细胞系的依赖T7 RNA聚合酶拯救系统，到利用真核细胞内广泛存在的RNA聚合酶Ⅱ仅需要将基因组cDNA克隆至真核表达载体CMV启动子的下游，即可简便高效地拯救病毒。RNA聚合酶Ⅱ反向遗传操作系统的出现极大的简化了负链RNA病毒的反向遗传操作，增强了病毒拯救的效率。
[0005]然而在病毒拯救过程中，需要模拟新城疫病毒自然感染机制，病毒基因组首先需要与核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)结合，从而形成核糖核蛋白聚合物(RNP)，作为病毒的最小感染单位，将病毒基因组RNA转录为正链RNA，并以此为模板合成病毒各结构蛋白，重新组装为新的子代病毒颗粒。这就要求在病毒拯救过程中至少需要基因组和三个辅助蛋白的参与，过去通常转染一个基因组cDNA克隆质粒和三个辅助质粒，并必须满足基因组质粒和三个辅助质粒同时进入一个细胞进行复制表达才能完成病毒的组装。由于传统四质粒拯救系统具有很高的拯救难度，因而导致其拯救效率低下。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对传统四质粒拯救系统拯救难度高、效率低下的问题，为了增加质粒进入同一个细胞的概率，提出一种新城疫病毒双质粒拯救系统及其构建方法，拯救效率更高。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，包括以下步骤：
[0009]S1、NDV LaSota株基因组全长克隆质粒pCI
‑
LaSota构建：
[0010]根据NDV LaSota株基因组序列，将全基因组分为5个末端部分重叠的基因片段并进行分段克隆，利用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点体外拼接为完整NDV LaSota株基
因组全长cDNA，并分别在5
’
端和3
’
端分别引入锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列，克隆于真核表达载体pCI中，构建为pCI
‑
LaSota，其核苷酸序列如SEQ No.1所示；
[0011]S2、辅助质粒PCI
‑
NPL构建：
[0012]以步骤S1中的cDNA为模板，分别扩增NP、P和L基因，并融合启动子和Poly A信号，构建为可共表达NP、P、L蛋白的三启动子辅助质粒PCI
‑
NPL，其核苷酸序列如SEQ No.2所示；
[0013]S3、双质粒拯救系统的构建：
[0014]采用磷酸钙法将NDV LaSota株基因组全长克隆质粒pCI
‑
LaSota和辅助质粒PCI
‑
NPL按2:1的比例共转染BHK
‑
21细胞，5天后收获转染细胞上清，接种SPF鸡胚尿囊腔，收获病毒尿囊液经过HA试验检测结果阳性者记为rLaSota保存。
[0015]进一步地，步骤S1中，NDV LaSota株基因组先通过PCR定点突变，将3155
‑
3162nt序列突变为PmeⅠ限制性酶切序列，再根据基因组内酶切位点PmeⅠ、XbaⅠ、BsiWⅠ、StuⅠ将LaSota基因组分为五个基因片段，五个基因片段的扩增产物分别为3216bp、3221bp、3014bp、2680bp、3985bp、2437bp片段。
[0016]进一步地，步骤S1中，在锤头状核酶序列上游引入MluⅠ限制性酶切位点，在丁型肝炎病毒核酶序列下游引入NotⅠ限制性酶切位点，利用MluⅠ和NotⅠ酶切位点将整个基因组连入pCI真核表达载体CMV启动子下游MluⅠ和NotⅠ位点之间，构建得到基因组全长质粒pCI
‑
LaSota。
[0017]进一步地，步骤S2中，以步骤S1中的cDNA为模板分别扩增NP、P基因的CDS区，根据L基因内XmaⅠ限制性酶切位点将L基因分为两段扩增，并在各基因CDS区上游引入Kozak序列GCCACC。
[0018]进一步地，步骤S2中，NP和P基因两端均分别引入NheⅠ和NotⅠ酶切位点，L基因两端分别引入XbaⅠ和NotⅠ酶切位点。
[0019]进一步地，步骤S2中，将扩增的NP、P和L基因分别连接至pCI表达载体多克隆位点上，记为pCI
‑
NP、pCI
‑
P、pCI
‑
L；再将NP、P基因分别与PolyA相连，得到NP
‑
PolyA和P
‑
PolyA，通过融合PCR的方法分别将CMV部分连接至NP
‑
PolyA和P
‑
PolyA的3
’
末端，组合成NP
‑
PolyA
‑
CMV和P
‑
PolyA
‑
CMV结构；NP
‑
PolyA
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CMV结构上游引入MluⅠ酶切位点、下游引入SacⅡ酶切位点，P
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PolyA
‑
CMV结构上游引入SacⅡ酶切位点，下游引入XbaⅠ酶切位点，使用相应限制性核酸内切酶消化，通过T4连接酶将NP
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PolyA
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CMV结构和P
‑
PolyA
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CMV结构依次连接到pCI
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L载体MluⅠ、SacⅡ、XbaⅠ之间，构建成三启动子辅助质粒pCI
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NPL。
[0020]进一步地，步骤S3双质粒拯救系统的具体方法为：
[0021]取5μg pCI
‑
LaSota、2.5μg pCI
‑
NPL和9μL 2M CaCl2溶液加入1.5ml离心管中，以无菌H2O补至75μL，颠倒混匀，少量多次逐步转入75μL预先准备好本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、新城疫病毒LaSota株基因组全长克隆质粒pCI
‑
LaSota构建：根据新城疫病毒LaSota株基因组序列，将全基因组分为5个末端部分重叠的基因片段并进行分段克隆，利用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点体外拼接为完整NDV LaSota株基因组全长cDNA，并分别在5
’
端和3
’
端分别引入锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列，克隆于真核表达载体pCI中，构建为pCI
‑
LaSota，其核苷酸序列如SEQ No.1所示；S2、辅助质粒PCI
‑
NPL构建：以步骤S1中的cDNA为模板，分别扩增NP、P和L基因，并融合启动子CMV和Poly A信号，构建为可共表达NP、P、L蛋白的三启动子辅助质粒PCI
‑
NPL，其核苷酸序列如SEQ No.2所示；S3、双质粒拯救系统的构建：采用磷酸钙法将新城疫病毒LaSota株基因组全长克隆质粒pCI
‑
LaSota和辅助质粒PCI
‑
NPL按2:1的比例共转染BHK
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21细胞，5天后收获转染细胞上清，接种于SFP鸡胚尿囊腔，收获病毒尿囊液经过HA试验检测结果阳性者记为rLaSota保存。2.根据权利要求1所述的新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，步骤S1中，新城疫病毒LaSota株基因组先通过PCR定点突变，将3155
‑
3162nt序列突变为PmeⅠ限制性酶切序列，再根据基因组内酶切位点PmeⅠ、XbaⅠ、BsiWⅠ、StuⅠ将LaSota基因组分为五个基因片段，五个基因片段的扩增产物分别为3216bp、3014bp、2680bp、3985bp、2437bp片段。3.根据权利要求1所述的新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，步骤S1中，在锤头状核酶序列上游引入MluⅠ限制性酶切位点，在丁型肝炎病毒核酶序列下游引入NotⅠ限制性酶切位点，利用MluⅠ和NotⅠ酶切位点将整个基因组连入pCI真核表达载体CMV启动子下游MluⅠ和NotⅠ位点之间，构建得到基因组全长质粒pCI
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LaSota。4.根据权利要求1所述的新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，步骤S2中，以步骤S1中的cDNA为模板分别扩增NP、P基因的CDS区，根据L基因内XmaⅠ限制性酶切位点将L基因分为两段扩增，并在各基因CDS区上游引入Kozak序列GCCACC。5.根据权利要求1所述的新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，步骤S2中，NP和P基因两端均分别引入NheⅠ和NotⅠ酶切位点，L基因两端分别引入XbaⅠ和NotⅠ酶切位点。6.根据权利要求1所述的新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，步骤S2中，将扩增的NP、P和L基因分别连接至pCI表达载体多克隆位点上，记为pCI
‑
NP、pCI
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P、pCI
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L；再将NP、P基因分别与PolyA相连，得到NP
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PolyA和P
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PolyA，通过融合PCR的方法分别将CMV部分连接至NP
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PolyA和P
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PolyA的3
’
末端，组合成NP
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建忠，王瑞楠，宗宪春，朱广美，段姝宇，胡静涛，杨桂连，王春凤，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：