表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达载体，通过该表达载体可以快速筛选得到细胞池，进一步筛选得到CHO克隆产生稳定CHO细胞系，还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量。提高了目的蛋白的表达量。

【技术实现步骤摘要】
表达载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及表达载体以及利用其筛选细胞池的方法。

技术介绍

[0002]中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是制造复杂生物分子的最常用表达宿主。在CHO细胞中表达蛋白质最常用的两种方法是瞬时基因表达和稳定基因表达。瞬时基因表达是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。瞬时基因表达是快速产生少量重组蛋白的首选方法，通常只需要1
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3周。但是，由于需要大量的DNA和宿主细胞，在需要生成克级蛋白质的情况下，瞬时基因表达并不适用。因此，稳定基因表达通常被用来产生克级重组蛋白。稳定基因表达是指转染的目的基因整合到染色体DNA中从而表达目的蛋白。然而，稳定基因表达既耗时又费力。通常需要3
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9个月才能产生CHO细胞系。因此，亟需快速、稳定、高产目的蛋白的细胞系。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种表达载体，通过该表达载体可以快速筛选得到细胞池，并且可通过进一步筛选得到CHO克隆，从而产生稳定的CHO细胞系。本专利技术中还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量，快速产生的CHO细胞系不仅稳定还高产。
[0004]第一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括筛选标记表达单元，至少一个目的基因表达单元，以及PiggyBac转座子的反向末端重复序列(ITRs)。
[0005]所述筛选标记表达单元包含筛选标记的编码序列，以及与所述筛选标记的编码序列可操作连接的第一调控序列，例如，启动子的编码序列和终止子的编码序列。
[0006]在一些实施方案中，所述筛选标记包括但不限于嘌呤霉素(Puromycin,Puro)、新霉素(Neomycin,Neo)，潮霉素B(Hygromycin B,Hygro B)和杀稻瘟菌素(Blasticidin,Bsd)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,DHFR)。优选地，所述筛选标记为人GS。
[0007]在一些实施方案中，所述筛选标记表达单元的启动子可以为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinasegene of Herpes simplex virus,HSV
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tk)启动子或猴空泡病毒40(Simian virus40,SV40)启动子。
[0008]在一些实施方案中，所述筛选标记表达单元的终止子可以为聚腺苷化信号(PolyA)，例如SV40 PolyA，牛生长激素(Bovine growth hormone，bGH)PolyA，HSV
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tk PolyA或兔β
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珠蛋白(Rabbit beta
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globin，RBG)PolyA，优选为SV40 PolyA。
[0009]优选地，所述筛选标记表达单元包含HSV
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tk启动子的编码序列和SV40 polyA的编码序列。
[0010]优选地，所述筛选标记表达单元包含HSV
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tk启动子的编码序列，人GS筛选标记的编码序列和SV40 polyA的编码序列。
[0011]所述目的基因表达单元包含目的基因序列，以及与目的基因序列可操作连接的第
二调控序列，例如，目的基因表达调控元件的编码序列和终止子的编码序列。
[0012]在一些实施方案中，所述目的基因表达调控元件的编码序列调控序列具有选自SEQ ID NO.1
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6所示的序列。
[0013]在一些实施方案中，所述目的基因表达单元的终止子可以为polyA，例如SV40 PolyA，bGH PolyA，tk PolyA，RBG PolyA，优选为bGH PolyA。
[0014]在一些实施方案中，所述目的基因为一个或者多个，例如2个，3个或者4个，相应地，所述表达载体具有2个，3个或者4个目的基因表达单元。
[0015]在一些实施方案中，所述目的基因编码anti
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CD20单克隆抗体(Rituximab)或anti
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HER2单克隆抗体(Trastuzumab)的轻链和/或重链。相应地，所述表达载体具有1个或者2个目的基因表达单元。
[0016]在一些实施方案中，所述表达载体可以快速筛选获得CHO细胞池，进一步筛选得到CHO克隆产生稳定CHO细胞系，还通过对表达载体中调控元件的优化，提高了目的蛋白的表达量，快速产生的CHO细胞系不仅稳定还高产。
[0017]第二方面，本专利技术提供了含有第一方面的表达载体的表达系统。
[0018]在一些实施方案中，所述表达系统还包含辅助质粒，所述辅助质粒编码PiggyBac转座酶。
[0019]第三方面，本专利技术提供了宿主细胞，所述宿主细胞转染有第一方面的表达载体。
[0020]在一些实施方案中，所述宿主细胞转染有第二方面的表达系统。
[0021]优选地，所述宿主细胞的基因组中稳定整合有第一方面的表达载体。
[0022]在一些实施方案中，所述宿主细胞不包含编码PiggyBac转座酶的辅助质粒。
[0023]在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞，例如为CHO
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K1细胞或CHOExpressTM细胞。
[0024]在一些实施方案中，所述宿主细胞为稳定的CHO细胞系。
[0025]在一些实施方案中，所述宿主细胞具有提高的目的蛋白表达量。
[0026]第四方面，本专利技术提供了利用第一方面的表达载体或第二方面的表达系统筛选细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0027](a)用第一方面的表达载体或第二方面的表达系统转染宿主细胞；以及
[0028](b)利用针对所述表达载体中的筛选标记的筛选试剂对步骤(a)获得的宿主细胞进行筛选的步骤。
[0029]在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞，例如为CHO
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K1细胞或CHOExpressTM细胞。
[0030]在一些实施方案中，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用10μg/ml的嘌呤霉素对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体。
[0031]在一些实施方案中，所述筛选标记为嘌呤霉素，并且使用浓度增高的嘌呤霉素(10μg/ml、50μg/ml、250μg/ml)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含嘌呤霉素抗性筛选标记的所述表达载体。
[0032]在一些实施方案中，所述筛选标记为GS，并且使用25μM的蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine,MSX)对宿主细胞进行筛选，所述宿主细胞转染有包含GS筛选标记的所述表达载体。
[0033]在一些实施方案中，所述筛选标记为GS，并且使用浓度增高的MSX(25μM、50μM)对宿主细胞进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，所述表达载体包括筛选标记表达单元，至少一个目的基因表达单元，以及PiggyBac转座子的反向末端重复序列。2.根据权利要求1的表达载体，其中，所述筛选标记表达单元包含筛选标记的编码序列，以及与所述筛选标记的编码序列可操作连接的第一调控序列，优选地，所述第一调控序列包括启动子的编码序列和终止子的编码序列。3.根据权利要求2的表达载体，其中，所述筛选标记为嘌呤霉素、新霉素、潮霉素B、和杀稻瘟菌素、谷氨酰胺合成酶、或二氢叶酸还原酶，优选地，所述筛选标记为人谷氨酰胺合成酶。4.根据权利要求2的表达载体，其中，所述筛选标记表达单元的启动子为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子、猴空泡病毒40启动子，和/或所述筛选标记表达单元的终止子为猴空泡病毒40聚腺苷化信号，牛生长激素聚腺苷化信号，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号或兔β
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珠蛋白聚腺苷化信号，优选为猴空泡病毒40聚腺苷化信号；优选地，所述筛选标记表达单元包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子的编码序列和猴空泡病毒40聚腺苷化信号的编码序列；优选地，所述筛选标记表达单元包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子的编码序列，人谷氨酰胺合成酶筛选标记的编码序列和猴空泡病毒40聚腺苷化信号的编码序列。5.根据权利要求1的表达载体，其中，所述目的基因表达单元包括目的基因序列，以及与目的基因序列可操作连接的第二调控序列，优选地，所述第二调控序列包括目的基因表达调控元件的编码序列和终止子的编码序列；优选地，所述目的基因表达调控元件的编码序列具有选自SEQ ID NO.1
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6所示的序列；优选地，所述目的基因表达单元的终止子为猴空泡病毒40聚腺苷化信号，牛生长激素聚腺苷化信号，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶聚腺苷化信号或兔β
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珠蛋白聚腺苷化信号，优选为牛生长激素聚腺苷化信号。6.一种表达系统，所述表达系统包括权利要求1
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5任一项的表达载体。7.根据权利要求6的表达系统，还包含编码PiggyBac转座酶的辅助质粒。8.一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有权利要求1
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5任一项的表达载体，或权利要求6或7的表达系统，优选地，所述宿主细胞的基因组中稳定整合有权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈潇，李京浩，亚娜，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司佛山普津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：