一种DNA银染方法技术

本发明专利技术公开了一种ＤＮＡ银染方法，该方法的步骤如下：（１）电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗２－３次；（２）银染：加入染色剂进行银染，并不停摇动，染色８－１２分钟，然后用蒸馏水漂洗２－３次；（３）显影：加入显影剂进行显色，并不停摇动，显影８－１２分钟；（４）用蒸馏水漂洗２－３次；（５）凝胶摄影：将凝胶平铺于Ｘ线胶片观片灯上照相。本发明专利技术的方法将固定步骤与染色步骤合而为一，采用乙醇进行固定，避免了常规银染方法中采用乙酸固定而带来的带色较浅，同时其具有刺激性气味，具有腐蚀性等缺陷；另外，本发明专利技术的方法无需采用乙醇或／和乙酸来终止显色，省去了终止显色步骤，避免了采用乙酸所带来的刺激性气味，具有腐蚀性等问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA银染方法，尤其涉及一种对变性聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)中DNA的银染及显色方法。
技术介绍
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 是分析蛋白质和核酸样品的一种常用的方法，由于其具有较高的分辨率，在 分子生物学及相关学科的研究中得以广泛的应用，尤其在AFLP、 SSR、 SNP等 分子标记研究和遗传图谱构建等方面应用更多。电泳后对样品的显示有许多 的方法，目标产物的检测主要采取显色法，目前采用的显色法大体有如下几 种(1)同位素放射自显影法，(2)荧光染料标记法，(3)溴化乙锭染色 法，其中，同位素放射自显影法具有灵敏度高、可靠性强等优点，但必须使 用同位素标记、凝胶转移、自显影等步骤，操作过程比较繁琐，且操作者易 遭受同位素照射的危险，需要外加特别的设备和防护措施，因而在推广应用 中有一定的难度；荧光染料标记法虽然克服了方法(1)中同位素对人的危害 性，但同时也降低了检测的灵敏度，并且操作过程同样繁琐，试验成本也较 高，需要有荧光显微镜等设备；溴化乙锭(EB)染色法方便易行，但聚丙烯酰 胺对溴化乙锭EB的荧光有猝灭作用，大大降低了溴化乙锭染色灵敏度，小于 lOng的DNA条带很难检测到，另外，往往要求产物的量较大，且EB具有致 癌性，使得对凝胶的操作和处理变得复杂起来。3采用银染法，可以有效地克服以上三种常见凝胶染色法的缺点，银染法 的基本原理为先用固定液将核酸固定到凝胶上，然后使银染液中的银离子 与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原，从而发生了显色反应，使得目 标产物能够凭肉眼即能看见。银染法对试剂的要求相对不高， 一般国产分析 纯试剂即可满足要求，并且固定液和染色液可以重复使用，降低了实验成本， 银染后的凝胶可以长期保存，更有利于对实验结果的回顾性分析。在目前的分子生物学研究上具有广泛的推广价值。目前较常用的是Bassam (1991)和 Sanguinetti (1994)的银染法，同时很多研究者根据自己的实践提出了不少 改进的银染法(Rderetal. ， 1998;许绍斌等2002)，主要用于聚丙烯酰胺 凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍，但银染色 后DNA不宜回收。银染法是迄今为止灵敏度最高的一种染色法，现有的银染 法大都存在有以下缺点(l)可能造成很高的背景特别在水不够纯的情况下； (2)费时费力(需要l 2h); (3)费用昂贵；(4)需要接触有毒的物质较多。目 前，常用的银染方法主要包含下面几个步骤(l)预处理与固定；(2)染色；(3) 显色；(4)终止反应。整个过程比较繁琐，需要用到去离子水、乙醇、硝酸、 硝酸银、碳酸钠、甲醛、硫代硫酸钠及乙酸等多种化学试剂。现有的银染方 法均需要采用乙醇或/和乙酸来终止显色，所用到试剂较多，操作步骤相对较 为复杂，相应地显色时间较长。目前所采用的银染方法每次染色时需配固定 液，显影液及染色液，染色液还要事先进行预冷等，同时在显影过程后期显 影速度很快，它要求带型显出时及时终止反应，如把握不当，随着染色时间 的延长，会使胶越染越黑，降低DNA带型与背景的对比度，染色效果较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作时间短，使用试剂少的对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA的银染方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案在于采用了 一种DNA银染方法， 该方法的步骤如下(1) 电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2—3次；(2) 银染加入染色剂进行银染，并用手或摇床不停摇动，染色8—12 分钟，然后用蒸馏水漂洗2—3次；(3) 显影加入显影剂进行显色，并用手或摇床不停摇动，显影8—12 分钟，至目的条带清晰为止；(4) 用蒸馏水漂洗2—3次；(5) 凝胶摄影将凝胶平铺于X线胶片观片灯上照相。步骤(2)中的染色剂由0.1—0.2%的AgNCb与10%的无水乙醇组成。 优选地，步骤(2)中的染色剂由0.2。/。的AgN03与10%的无水乙醇组成， 0.2%硝酸银染色后，带型显色更深，更快，灵敏度更高；染色过程中加入10% 的无水乙醇，后续显色过程快，条带不飘移，带型整齐。步骤(3)中的显影剂由2—3。/。的NaOH和0.2—0.4%的甲醛组成。 优选地，步骤(3)中的显影剂由2—3。/。的NaOH和0.3y。的甲醛组成。 本专利技术的方法，将固定步骤与染色步骤合而为一，且采用乙醇进行固定， 避免了常规银染方法中采用乙酸固定而带来的带色较浅，同时其具有刺激性 气味，具有腐蚀性等缺陷；同时，乙醇和硝酸银配制在一起，可使后续显色 过程快，条带不飘移，带型整齐。显影剂中，甲醛的作用是将银离子还原为金属银，显色时，当甲醛浓度较高时，染色时间縮短，但胶颜色发黄，背景 污浊，且相互反差变小，使不同分子量的DNA不能同步显色，影响灵敏度；浓度低时，不仅染色时间延长而且不易着色，本专利技术优选0.3%的甲醛，可以 获得高敏感性和特异性的银染结果；氢氧化钠在显影剂中起提供碱性环境、 促进显影剂显影能力的作用。另外，本专利技术的方法无需采用乙醇或/和乙酸来 终止显色，省去了终止显色步骤，避免了采用乙酸所带来的刺激性气味，具 有腐蚀性等问题。本专利技术的DNA银染方法只需要配制染色剂和显影剂两种溶液，染色过程 中明显的减少了溶液配制的种类，从而大大简化了显色程序；且本专利技术的方 法在染胶过程中省去了常规方法中使用的显影步骤所采用的硫代硫酸钠及终 止显色步骤所用到的乙酸，减少了试剂的用量，降低了成本；更重要的是它 省时省力，操作简便，显影过程比较温和，容易控制，当把凝胶放入显影剂 中，最初5min无明显变化，在以后的2-4min逐渐显出带型，当带型都显出 来后，背景颜色基本不变，由此可见采用本专利技术的方法显影容易控制。本专利技术所用NaOH的浓度较低，即使适当延长染色时间，也不会把胶染黑， 因此不用停显的步骤，在带型显出后，仅用蒸馏水漂洗，洗掉胶上残存的显 影液即可。本专利技术对聚丙烯胺凝胶电泳技术染色方法及其最适条件进行了探索，经 过多次实验，最终研究建立了一种DNA银染方法，在大幅度提高检测灵敏度 的同时，可有效地控制凝胶的染色背景，步骤简单，容易操作，整个染色过 程所需时间短(15—20min)，利用本专利技术的银染法对葡萄微卫星DNA扩增产物 的PAGE凝胶进行染色取得了十分满意的效果。另外，本专利技术的方法克服了许多非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法的 不足，省时简便且重复性好，确保了非变性聚丙烯酰氨凝胶中阳性条带的显 示与观察，能够达到准确筛查和精确定量的目的，对筛查出的阳性标本进行 有目的的测序，可避免盲目测序所带来的资金浪费。 附图说明图1为本专利技术银染方法的银染效果图； 图2为常规方法的银染效果图。具体实施方式 实施例1本专利技术DNA银染方法的步骤如下(1) 电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，放 入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗2次；(2) 银染加入染色剂进行银染，并用手或摇床不停摇动，染色10分钟，然后用蒸馏水漂洗2次，其中染色剂由0.2y。的AgN03 (W/V)与10%的无水乙 醇(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ银染方法，其特征在于：该方法的步骤如下：　（１）电泳结束后切断电源，从电泳槽中倒出缓冲液，然后取下胶板，放入装有蒸馏水的瓷盘中，用蒸馏水漂洗２－３次；　（２）银染：加入染色剂进行银染，并不停摇动，染色８－１２分钟，然后 用蒸馏水漂洗２－３次；　（３）显影：加入显影剂进行显色，并不停摇动，显影８－１２分钟；（４）用蒸馏水漂洗２－３次；　（５）凝胶摄影：将凝胶平铺于Ｘ线胶片观片灯上照相。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白晓燕，段佩楠，段书延，高珊珊，关小燕，郭大龙，吴正景，张国海，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]