一种明胶微球载体及其应用制造技术

本申请公开了一种明胶微球载体及其应用，以明胶为主体，制成水溶液，加入柠檬酸调节pH至酸性可抑制交联剂京尼平的反应，再加入京尼平为交联剂，通过滴注进入液氮冷冻一步成型，再与碳酸氢钠反应将pH调节至碱性，促进京尼平进行交联固化，得到明胶微球载体。本申请的明胶微球载体制备工艺简单，稳定性强利于储藏、且制备成本低，对细胞无害、能有效负载细胞并扩增细胞，可用于细胞3D培养。可用于细胞3D培养。可用于细胞3D培养。

【技术实现步骤摘要】
一种明胶微球载体及其应用


[0001]本申请涉及生物医药材料
，具体而言，涉及一种明胶微球载体及其应用。

技术介绍

[0002]与传统的平面细胞培养技术相比，三维细胞培养技术能够较为真实地模拟生物体内细胞的存活环境，更逼真的还原出细胞间相互作用和生理生化反应，以及细胞对内源性和外源性刺激如温度、pH、转运和分化等方面的改变所作出的实际应答。3D细胞培养可以用于构建类器官模型或是肿瘤模型，以更为准确贴合的方式进行如药物的代谢动力学研究、药效评估以及更加直观的细胞生物学方面的研究，使得3D细胞培养成为必不可少的研究工具。
[0003]目前，以明胶作为细胞负载基质或是制成球型载体是当前3D细胞培养的研究热点。明胶是动物胶原蛋白部分水解后的主要产物，具有良好的生物降解性、生物相容性、无毒性、亲水性和非免疫原性等生物特性，在药品、食品、组织工程、农业领域都是广泛应用的功能性生物高分子材料。
[0004]明胶微球的制备技术较为成熟，目前有乳化交联、溶剂挥发、喷雾干燥和相分离等多种制备方法。大部分方法都是通过油相和水相乳化搅拌剪切成球，再使用交联剂如甲醛、戊二醛固化成明胶微球。也有使用其他交联剂进行反应的，如CN109793717A公开了一种明胶微球的制备方法与应用，以明胶水溶液为水相，石蜡为油相乳化搅拌成球经过冷冻后，再由京尼平进行交联。或者是通过微流控制芯片成型的方法，如CN110200922B公开了一种明胶微球的制备方法及应用，以明胶水溶液为水相，油为油相经过微流控装置成液滴进入收集相，然后在4
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12℃下成胶，最后使用京尼平进行交联。这两个制备方法所使用的交联剂京尼平是一种植物天然交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，但是这两个制备方法在微球成型过程中需要使用油相。再如CN112250892A先将明胶溶液进行喷雾干燥或是喷雾冻干处理获得微球前体，微球前体再于不良溶剂如甲醇、丙酮及乙腈等溶剂或水溶液中进行交联固化，但是CN112250892A在固定阶段使用有机溶剂固化或有机溶剂进行保护球体形状，在成球后必须设法除去使得清洗步骤较为麻烦，加大成本。也有未使用交联剂进行固化微球的，如CN112266487A是以壳聚糖为骨架固定明胶，将壳聚糖明胶溶液冷冻喷雾处理，再于赋形剂如糖、葡聚糖、明胶、甘露醇等保护下冻干处理得到微球，但是该方法需要喷雾干燥以及多次冷冻干燥处理，制备过程复杂时间较长，涉及不同设备的使用，加大成本。因此，需要提供一种制备过程简单安全，绿色环保且不伤害细胞的活性，能够有利于干细胞贴附以及扩增，且节省成本方便大规模生产的微球的制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种一种明胶微球载体，采用如下方法制备：
[0006]步骤一，取明胶溶于温水中，搅拌均匀，得到明胶水溶液；
[0007]步骤二，将柠檬酸加入步骤一制备的明胶水溶液调节pH≤3，溶解拌匀，得到柠檬酸明胶溶液；使用柠檬酸调节明胶水溶液的pH≤3可以抑制交联剂的反应活性，延长明胶、柠檬酸和京尼平混合溶液的使用时间。
[0008]步骤三，将京尼平粉末加入到步骤二制备的柠檬酸明胶溶液，溶解拌匀，制成明胶混合溶液；
[0009]步骤四，将步骤三制备的明胶混合溶液滴注至液氮中，凝固成型，得到明胶微球；
[0010]步骤五，将步骤四制备的明胶微球放入碳酸氢钠溶液中，反应3h或待球体变为浅蓝色提示反应完成后，用水洗净获得明胶微球载体。
[0011]进一步的，所述的明胶微球载体的制备方法还包括如下(1)
‑
(7)中的一项或多项：
[0012](1)每升所述明胶水溶液中明胶的添加量为50
‑
300g；
[0013](2)每升所述柠檬酸明胶溶液中柠檬酸的添加量为10
‑
50g；
[0014](3)每升所述明胶混合溶液中京尼平的添加量为3
‑
10g；
[0015](4)通过针头将明胶混合溶液滴注到液氮中；
[0016](5)所述碳酸氢钠溶液pH为8
‑
9；
[0017](6)所述碳酸氢钠溶液的浓度为10
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50g/L；
[0018](7)所述温水的温度为55
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60℃。
[0019]所述明胶为胶强度为250g bloom的明胶和100g bloom的明胶混合物，其质量比为0.5
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1：0
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0.5。所述明胶的来源为鱼皮、猪皮、猪骨、牛皮、牛骨中的一种或是几种。
[0020]所述针头型号为4号或5号针头。
[0021]可替换的，在所述步骤一制备的明胶水溶液中可以先添加京尼平粉末再加入柠檬酸调节pH≤3，获得所述明胶混合溶液。
[0022]本专利技术还提供一种前述的明胶微球载体在细胞3D培养产业链中的应用。
[0023]进一步的，所述明胶微球载体用于干细胞3D培养。
[0024]所述明胶微球载体使用乙醇灭菌和/或辐照灭菌后，用于干细胞3D培养。具体的，所述乙醇灭菌是将所述明胶微球载体放入无水乙醇中浸泡30min；和/或，所述辐射灭菌是将所述明胶微球载体在紫外灯下辐射过夜。
[0025]本专利技术的有益效果包括：本专利技术提供的明胶微球载体，其制备工艺简单，只需原材料明胶、柠檬酸和京尼平混合再经过冷冻塑型即可，减少了有机溶剂如各种与水不混溶的油相和油相清洗剂的使用；固化工艺采用了天然交联剂京尼平，对人体无害，对细胞的活性不构成影响，不必像使用甲醛或是戊二醛交联剂需要有除去的步骤；通过控制pH低于3可以抑制京尼平反应活性，明胶柠檬酸京尼平混合液的保存或是使用时间可延长数天，在调节pH高于8时仍可以恢复反应活性，且京尼平具有一定的抑菌性能保护原料液被细菌分解；明胶微球使用液氮冷冻预先成型，可以使得明胶微球前体在常温水中形状不会变化，因此也不需要使用赋形剂或是不良溶剂进行保护；所使用的碳酸氢钠洗涤剂，可以将微球前体中柠檬酸中和，同时产生气泡在球体表面制造孔隙，且碳酸氢钠pH相对于氢氧化钠或是碳酸钠更为温和，更适合于京尼平进行交联反应；微球的尺寸可以通过选择不同型号的针孔和流速的大小进行调节；微球制备工艺简单，相较其他制备方法更为节省成本，具备大规模生产的潜力；明胶微球具有稳定性和一定的耐酸碱能力，利于贮藏；明胶微球能被胶原酶特异分解而不损伤细胞，具备一定的机械强度，可以有效负载并扩增细胞，且对细胞无害。
附图说明
[0026]图1为显微镜四倍镜头下的实施例1制备的明胶微球载体图片；
[0027]图2为扫描电镜下实施例1制备的明胶微球载体表面形貌图片；
[0028]图3为毛囊干细胞在明胶微球载体表面的贴附情况；
[0029]图4为明胶微球载体表面附着细胞的活力情况。
具体实施方式
[0030]下面结合实施例对本专利技术进行进一步说明和描述，但所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种明胶微球载体，其特征在于，所述明胶微球载体采用如下方法制备：步骤一，取明胶溶于温水中，搅拌均匀，得到明胶水溶液；步骤二，将柠檬酸加入步骤一制备的明胶水溶液调节pH≤3，溶解拌匀，得到柠檬酸明胶溶液；步骤三，将京尼平粉末加入到步骤二制备的柠檬酸明胶溶液，溶解拌匀，制成明胶混合溶液；步骤四，将步骤三制备的明胶混合溶液滴注至液氮中，得到明胶微球；步骤五，将步骤四制备的明胶微球放入碳酸氢钠溶液中，反应3h或待球体变为浅蓝色后，用水洗净获得明胶微球载体。2.根据权利要求1所述的明胶微球载体，其特征在于，包括如下(1)
‑
(7)中的一项或多项：(1)每升所述明胶水溶液中明胶的添加量为50
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300g；(2)每升所述柠檬酸明胶溶液中柠檬酸的添加量为10
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50g；(3)每升所述明胶混合溶液中京尼平的添加量为3
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10g；(4)通过针头将明胶混合溶液滴注到液氮中；(5)所述碳酸氢钠溶液pH为8
‑
9；(6)所述碳酸氢钠溶液的浓度为10
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【专利技术属性】
技术研发人员：方达通，丁鹏飞，黎钟秀，甘武，
申请(专利权)人：上海英拜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：