本发明专利技术公开了一种OTUD3蛋白去泛素化稳定Rab7a增强细胞自噬的应用，首先公开了OTUD3蛋白通过其OTU结构域与Rab7a相互作用，通过去泛素化作用延长Rab7a的半衰期，维持Rab7a稳定性；通过维持Rab7a的稳定性，OTUD3促进细胞的自噬流，缺失OTUD3后，BCG感染巨噬细胞后其与溶酶体的共定位明显减弱；本发明专利技术证明了OTUD3通过去泛素化并稳定晚期内体标志分子Rab7a，增强细胞溶酶体酸化成熟，缺失OTUD3巨噬细胞溶酶体的酸化过程受到抑制，使促进OTUD3表达或激活其活性成为细胞溶酶体酸化作用增强，促进宿主细胞清除病原感染的潜在药物靶标。进宿主细胞清除病原感染的潜在药物靶标。进宿主细胞清除病原感染的潜在药物靶标。
【技术实现步骤摘要】
一种OTUD3蛋白去泛素化稳定Rab7a促进细胞自噬的机制及其应用
[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种通过OTUD3蛋白增强Rab7a稳定性促进细胞溶酶体酸化的应用。
技术介绍
[0002]泛素蛋白酶体系统(ubiquitin
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proteasome system,UPS)是真核细胞内定向降解蛋白质的重要途径，参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。
[0003]在宿主细胞抵抗病原感染的免疫反应过程中，Rab蛋白具有重要功能。吞噬，自噬，抗原提呈过程以及免疫受体的膜内转运都离不开Rab分子的参与，值得一提的是，Rab7蛋白均参与了这些免疫反应过程。1.吞噬作用：在病原菌被吞噬之后，进入Rab5标记的内体，而Rab5活化后的效应蛋白Mon1
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Ccz1恰恰是Rab7的GEF，因而Rab7被募集并激活；同时，Mon1
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Ccz1可以使Rabex5(Rab5的GEF)脱离，降低活性Rab5的形成，Rab7募集Rab5的GAP使已有的Rab5
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GTP水解，这最终会使得Rab5标记的内体转变为Rab7标记的晚期内体，为下一步进入溶酶体做准备。2.自噬：作为Rab7的GEF，Mon1
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Ccz1含有可以与自噬体，于是Rab7可以促进自噬流，而突破内体膜的病原菌可以被泛素化标记后经过自噬途径被清除。3.适应性免疫：抗原提呈细胞吞噬的病原菌需在吞噬体或早期内体中初步降解，然后与主要组织相容复合物结合，并运输到细胞膜表面，用于活化抗原识别B细胞或T细胞，抗原处理过度(即进入溶酶体降解)则显著降低抗原提呈效率，文献报道，线粒体抗原的提呈过程中，包含线粒体的膜泡与溶酶体融合的过程即是Rab7依赖的。4.免疫受体的膜内转运：Rab7b促进TLR4的溶酶体降解负向调节巨噬细胞TLR4信号。显然，Rab7的介导下，宿主细胞的吞噬和自噬过程发挥免疫防御作用直接清除病原菌，适应性免疫的激活可深入清除病原菌，而免疫受体的及时降解可以避免宿主细胞免疫反应过度，及时回归稳态。而且，病原菌通过分泌毒力因子(virulence factors)作用于宿主细胞内的膜泡运输途径，使其成为适宜自身生存的生境，被吞噬的细菌可以在内吞体生存并复制。Rab7是细菌毒力因子作用的重要靶蛋白，如RidL(由Legionella pneumophila产生)和SopD2(Salmonella enterica产生)可影响Rab7的功能。RidL可将TBC1D5(Rab7的GAP)从反向转运体(retromer)替换下来，使Rab7
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GTP持续定位于retromer，而竞争性地影响Rab7定位于内体使其向溶酶体的转运；SopD2能够结合并稳定Rab7
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GDP，抑制Rab7的激活。而Salmonella Typhimurium感染导致Rab7的苏木化修饰功能异常，最终使得Salmonella Typhimurium不能被有效清除。因此，病原菌通过劫持Rab7的功能，在宿主细胞成功定居。
[0004]正常情况下，Rab7的表达，定位与激活会受到严格调控，其异常与肿瘤，神经退行性疾病相关。作为小G蛋白，以往关于Rab7的研究主要集中在GEF，效应蛋白和GAP。Mon1
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Ccz1是Rab7仅有的GEF，进化保守，与其他Rab家族的GEF在结构上也显著不同。Rab7的GAP包括TBC1D2A(Armus)，TBC1D2B，TBC1D5，TBC1D15，不同的GAP定位于不同的细胞器，但这些蛋
白都含有保守的Tre2/Bub2/Cdc16(TBC)结构域，负责激活Rab GTPase水解酶活性。Rab7的效应蛋白种类多，分布广，这赋予了Rab7复杂多样的功能，包括内吞体成熟，线粒体分裂，反向转运(Retrograde trafficking)。此外，Rab7还存在复杂的翻译后修饰，如棕榈酰化，磷酸化，苏木化以及泛素化，尽管人们Rab7的认识不断加深，但是许多关键问题(如Rab7时空性，特异性地在不同膜泡上执行转运，缝合，定位，融合功能)仍然没有解决。
技术实现思路
[0005]为填补上述机理空白，本专利技术鉴定了OTUD3蛋白作为Rab7a的去泛素化酶可稳定Rab7a的表达，且缺失OTUD3后巨噬细胞溶酶体的酸化过程受到抑制。本专利技术首先利用IP
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MS鉴定到OTUD3与Rab7a相互作用，进而通过转染过表达实验证实OTUD3与Rab7a共定位，并通过去泛素化实验证实OTUD3酶活依赖地方式去除Rab7a的多聚泛素链，稳定Rab7a的蛋白水平。功能方面，本专利技术通过转染实验证实OTUD3增强细胞自噬流，而利用BCG感染原代骨髓来源巨噬细胞实验证实缺失OTUD3后细胞的溶酶体酸化过程受抑制。
附图说明
[0006]图1.OTUD3与Rab7a特异性互作；
[0007]图2.OTUD3去泛素化并稳定Rab7a；
[0008]图3.过表达OTUD3增强细胞自噬；
[0009]图4.BCG感染引起OTUD3和Rab7a表达上调；
[0010]图5.缺失OTUD3后，BCG与溶酶体共定位减弱。
具体实施方式
[0011]以下通过参考示范性实施例，本专利技术的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本专利技术并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本专利技术的具体细节。
[0012]实施例1Rab7a是OTUD3的相互作用蛋白
[0013]为确证Rab7a与去泛素化酶OTUD3的相互作用，选择购自ATCC的HEK293T过表达Flag
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OTUD3质粒载体和不同GFP标签Rab家族蛋白，通过免疫共沉淀技术检测相互作用情况。
[0014]其中蛋白质免疫共沉淀方法的实施步骤为：
[0015]1.细胞转染：T25培养瓶培养HEK293T细胞至80％汇合度，进行质粒转染；
[0016]2.细胞收集：36hrs后，弃掉培养基，预冷PBS涮洗细胞一次，用细胞刮收集细胞，然后PBS洗1次，3000rpm离心3min，弃上清；
[0017]3.细胞裂解：加600μL HEPES裂解液(加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)重悬细胞，冰上裂解10min后继续冰浴中超声破碎细胞(30w，3min，开1s、关1.5s)，4℃，12000rpm离心10min，收集上清；
[0018]4.预清除：向上述上清中加入20μL protein
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A/G
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agarose beads，4℃旋转混合器上孵育3hrs，1000rpm离心1min，收集上清；
[0019]5.抗原抗体结合：取上清40μL作为总细胞lysate，向其余上本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.OTUD3相关的生物制品在制备促进Rab7a表达中的试剂中的应用，所述的OTUD3相关生物制剂包括：1)编码OTUD3的核酸分子；2)OTUD3的蛋白分子；3)含有1)所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；4)含有1)所述的编码OTUD3核酸分子或含有3)所述表达盒的载体。2.根据权利要求1所述的应用，其中OTUD3与Rab7a通过直接相互作用，促进Rab7a去泛素化实现。3.OTUD3相关的生物制品在制备延长Rab7a在细胞中半衰期的试剂中的应用，所述的OTUD3相关生物制剂包括：1)编码OTUD3的核酸分子；2)OTUD3的蛋白分子；3)含有1)所述的编码OTUD3核酸分子的表达盒；4)含有1)所述的编码OTUD3核酸分子或含有3)所述表达盒的载体。4.根据权利要求3所述的应用，其中OTUD3与Rab7a通过直接相互作用，促进Rab7a去泛素化实现。5.OTUD3相关的生物制品在制备促进细胞自噬的试剂中的应用，所述的OTU...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴波，强丽华，张令强，李洪昌，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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