一种单细胞代谢物活体原位检测方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞代谢物活体原位检测方法，该方法包括以下步骤：建立单细胞细胞质取样体积/单细胞体积相对定量方式，获取维持单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积；搭建复合型离子源，获取从单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积，得到单细胞细胞质在代谢组活体原位检测中的取样体积；通过皮升泵探针显微镜定点定位刺穿细胞膜，提取上述取样体积的细胞胞质；使用复合型离子源对提取的单细胞细胞质中的代谢物进行电离；将电离后的代谢物进行质谱检测。本发明专利技术可以实现对发育过程中的活体胚胎进行多次单细胞细胞质提取，进行质谱代谢物检测，在保证细胞存活，多次取样的同时，实现对单细胞内痕量代谢物的精准检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞代谢物活体原位检测方法


[0001]本专利技术属于单细胞检测
，具体涉及一种单细胞代谢物活体原位检测方法。

技术介绍

[0002]细胞是生物体形态最基本的结构和生理功能的基本单位。由于细胞与细胞之间具有显著的异质性，因此生物组织和体外细胞群体所得测量结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。为了更深层次地探索微观生命活动的基本规律，获得更为精准和全面的细胞生物学信息，必须从单细胞水平进行准确测量研究。
[0003]单细胞的原位分析对于获取细胞的空间信息，监测细胞间的相互作用过程，研究胞外微环境对细胞代谢的影响都起到至关重要的作用。然而，目前对单细胞的分析手段，均需要分离单个细胞并且破坏细胞结构，如何实现在活生物体原位分析单个细胞成为当今国际难题。
[0004]近年来，单细胞质谱(Single
‑
cell mass spectrometry，SCMS)作为一种具有高灵敏度和高特异性的非标记检测技术，在单细胞代谢物学和蛋白质组学等方面得到了越来越广泛的应用。单细胞质谱技术在无需扩增或标记的情况下，能够实现细胞内多种生物分子的高灵敏度同时检测。质谱通过多级碎裂的方式，利用分子的特征碎片信息还可以实现单细胞内未知化合物的结构解析。但是单细胞质谱检测需要彻底破坏细胞，让细胞丧失生命。为实现原位活细胞细胞质质谱代谢组定量检测，需要准确把握以下平衡。
[0005]1)增加细胞质提取量可以提高质谱检测准确性，但会使细胞丧失活性。
[0006]2)减少细胞质提取量可以增加细胞存活概率，但会减低质谱检测准确性。
[0007]因此如何确定细胞质的提取量，既保证细胞可以继续存活，又能保证质谱检测灵敏度是目前无法实现单细胞代谢物活体原位检测的关键问题。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种单细胞代谢物活体原位检测方法。
[0009]为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0010]提供一种单细胞代谢物活体原位检测方法，该方法包括以下步骤：
[0011]步骤1、建立单细胞细胞质取样体积/单细胞体积相对定量方式，获取维持单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积；
[0012]步骤2、搭建复合型离子源，获取从单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积；
[0013]步骤3、根据单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积和单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积，得到单细胞细胞质在代谢组活体原位检测中的取样体积；
[0014]步骤4、使用单细胞显微操作技术，通过皮升泵探针显微镜定点定位刺穿细胞膜，
提取上述取样体积的细胞胞质；
[0015]步骤5、使用皮升紫外光电离－诱导电喷雾复合型离子源对提取的单细胞细胞质中的代谢物进行电离；
[0016]步骤6、将电离后的单细胞细胞质中的代谢物进行质谱检测。
[0017]本专利技术的有益效果为：
[0018]建立了一种活体原位单细胞代谢物采样、检测、分析技术，可以实现对发育过程中的活体胚胎进行多次单细胞细胞质提取，进行质谱代谢物检测，在保证细胞存活，可以多次取样的同时，实现对单细胞内痕量代谢物的精准定量分析，最终获取单细胞空间，时间和代谢物的信息。
附图说明
[0019]图1为本专利技术方法取样、进样、检测示意图。
具体实施方式
[0020]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0021]实施例
[0022]本实施例使用小鼠胚胎作为研究对象，使用单细胞显微操作技术，通过皮升泵探针显微镜定点定位刺穿细胞膜，提取细胞胞质，实现对活体细胞细胞质的原位提取且保证细胞继续存活。同时研发“皮升紫外光电离－诱导电喷雾”复合型离子源，提高离子化效率，减少样本需求量。等待胚胎细胞恢复活性并继续增殖，再次对胚胎进行单细胞定位取样质谱代谢物检测，对单个细胞实现3次以上细胞质取样及代谢物检测。具体分为以下内容：
[0023](1)活细胞质采集
[0024]活细胞质采集核心在于提取足够量的细胞质，满足质谱检测条件，同时保证细胞存活。首先拟建立单细胞细胞质取样体积/单细胞体积相对定量方式。在本实施例中，使用传统方法估算细胞体积测量细胞体积：使用目镜测微尺测量胚胎细胞长度与宽度，取其一半为长半径和短半径，代入公式求体积。其次使用荧光定量法，对细胞质进行整体荧光标记，以未取样时单个细胞荧光强度代表细胞体积，在细胞质提取后，以剩余荧光强度代表剩余体积，做追踪，确定细胞质提取体积相对于细胞体积的大小。
[0025]除生物特性外，细胞异质性导致单个细胞在大小，形状等物理特性上也具有差异。对于不同大小，形状的单细胞，如何确定每个细胞的取样体积，需要依据细胞本身体积进行计算；其次，针对单细胞体积，使用皮升泵对单细胞细胞质进行定量提取的方法；再次，摸索维持细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积。最后，建立一套使用显微镜皮升泵连用定量提取单细胞细胞质，保证胚胎可继续存活并繁殖的技术方法。
[0026]皮升泵可通过压力传感器精确测量进样针在提取细胞液时的压力变化，以此精密控制取样体积，并且能够保证取样过程中不会受到周围细胞的污染。该方法能够实现对取样过程中细胞液体积的精确控制，避免了由于取样体积造成的定量误差；研究拟引入内标
物，避免直接取样的过程中细胞内化合物提取效率的误差，以确保一些低含量的化合物不会因基质效应在质谱中难以检测。
[0027](2)研发创新型离子源，增加检测灵敏度，建立分析条件
[0028]基于实验室基础，研发一种新型组合式离子源增加对微量样本测试的灵敏度，降低测样体积的需求量。优化光电离质谱离子源设备(APPI)，进一步建立皮升紫外光电离质谱离子源设备；同时发展非接触式电喷雾离子源技术。随后将二者组合，研发“皮升紫外光电离－诱导电喷雾”组合型离子源，通过对装置各项参数条件的优化，实现加对微量样本的高效离子化和高灵敏度测量；通过内标引入，建立单细胞代谢物准确定性和相对定量质谱分析方法；优化条件后，摸索从单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积。
[0029]在本实施例中，根据单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积和单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积，得到单细胞细胞质在代谢组活体原位检测中的取样体积；使用单细胞显微操作技术，通过皮升泵探针显微镜定点定位刺穿细胞膜，提取上述取样体积的细胞胞质；使用皮升紫外光电离－诱导电喷雾复合型离子源对提取的单细胞细胞质进行电离；将电离后的单细胞细胞质进行胚胎单细胞代谢物的检测。
[0030]本申请紧密围绕生命健康领域，拟建立一种活体原位单细胞代谢物采样、检测、分析技术，对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞代谢物活体原位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、建立单细胞细胞质取样体积/单细胞体积相对定量方式，获取维持单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积；步骤2、搭建复合型离子源，获取从单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积；步骤3、根据单细胞存活时的相对最大细胞质抽取体积和单个细胞质中检出150种代谢物的最小取样体积，得到单细胞细胞质在代谢组活体原位检测中的取样体积；步骤4、使用单细胞显微操作技术，通过皮升泵探针显微镜定点定位刺穿细胞膜，提取上述取样体积的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛志超，尹欣驰，谭思源，戴新华，方向，龚晓云，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：