一种芦笋EST-SSR分子标记的开发方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种芦笋EST

【技术实现步骤摘要】
一种芦笋EST
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SSR分子标记的开发方法及应用


[0001]本专利技术属于分子标记开发及应用领域，具体涉及一种芦笋EST
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SSR分子标记的开发方法及应用。

技术介绍

[0002]芦笋（Asparagus officinalis L.）是一种重要的蔬菜作物，富含氨基酸、维生素、矿物质等人体必需的营养元素，以及皂苷、芦丁、类黄酮等生物活性成分，具有极高的营养、保健和药用价值，深受消费者喜爱。芦笋是典型的雌雄异株、多年生作物，基于表型选择的传统育种手段存在周期长、难度大等缺陷，导致品种更新换代速度难以满足生产需求，尤其是缺少抗病、高品质和设施专用品种。分子标记辅助选择（MAS）是对基因型进行直接选择，不受生长条件、取材部位和株龄影响，可实现对目标基因的加速聚合，缩短育种周期。其中，开发信息完善的分子标记是MAS的基础。然而，据我们所知，芦笋中可供利用的分子标记数量仍非常有限，尤其是高质量的EST
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SSR分子标记，难以满足分子育种需求。
[0003]简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）是由1
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6个核苷酸组成的基序，经多次重复形成的DNA片段，广泛分布于基因组。SSR基序重复次数高度变化、侧翼序列相对保守，导致PCR产物长度多态性，SSR分子标记应运而生。与RAPD、SRAP等分子标记相比，SSR标记因具有分布广泛、多态性高、重复性好、共显性和操作简便等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、农艺性状定位及标记辅助选择育种等领域。近年来，高通量测序技术的简单化和低成本化为众多物种提供了丰富的核苷酸数据，极大促进了SSR标记开发。据序列来源不同，SSR常被分为2类：来源于基因组序列的基因组SSRs和来源于RNA序列的EST
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SSRs。EST
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SSRs来源于基因内部，保守性更高，基序重复次数变化即可能对基因功能或表达产生影响。因此，与基因组SSR相比，EST
‑ꢀ
SSRs往往具有更高的种间通用性、标记辅助选择效率和功能标记潜在性，利用价值更高。但是，现今不同物种EST
‑ꢀ
SSR分子标记开发中，普遍存在引物有效扩增偏低的问题，如牡丹（51.50%）、细叶苔草 （74.61%）等。非有效扩增引物主要包括引物无扩增产物、扩增产物条带大小与预期严重不符、存在其他与目标条带大小相似的扩增产物及扩增产物无SSR位点等类型，其产生原因主要有引物位于剪接位点、扩增产物含有大的内含子及引物在基因组中存在非惟一结合位点等，不仅给新开发标记的实际应用造成一定浪费，而且影响基因型鉴定的准确性。因此，如何剔除非有效引物，已成为EST
‑ꢀ
SSR分子标记开发中亟待解决的关键问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种芦笋EST
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SSR分子标记开发方法及应用。该专利技术一方面，可解决传统EST
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SSR分子开发方法中存在的非有效引物率偏高的问题，可为芦笋及其他物种的EST
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SSR分子标记开发提供借鉴；另一方面，可丰富芦笋的分子标记数量，用于芦笋及近缘物种的亲缘关系评价。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
一种芦笋EST
‑ꢀ
SSR分子标记开发方法及应用，开发流程如图1，具体包括以下步骤：（1）Unigene序列的获得：对芦笋转录组测序数据进行过滤、组装，获得Unigene数据库；（2）SSR位点鉴定及引物批量设计：采用MISA软件对Unigene序列进行SSR位点检索；采用Primer 3.0软件批量设计EST
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SSR引物；（3）SSR有效引物的筛选：以芦笋基因组序列为模板，采用TB
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tools软件批量e
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PCR检测和NCBI的Primer
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blast逐一e
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PCR检测相结合的方法剔除非有效引物，并将其分为6类：无扩增产物（Ⅰ类）、扩增产物大小与预期严重不符（Ⅱ类）、扩增产物物理位置不确定（Ⅲ类）、在在2个及以上与目的条带大小相似的扩增产物（Ⅳ类）、扩增产物无SSR位点（V类）及所属基因不明确的引物（
Ⅵ
类）。进一步，随机选取
Ⅰ‑Ⅵ
类非有效引物各10对，进行PCR扩增及产物测序验证。然后，借助芦笋基因组及注释文件，完善EST
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SSR标记的物理位置、所属基因、ORF及潜在功能等信息，并绘制染色体密度分布图。
[0006]（4）SSR引物的多态性鉴定及通用性分析：以9个芦笋品种为材料，采用CTAB法提取DNA，随机选择均匀分布于10条染色体的50对EST
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SSR引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据条带大小，统计有效扩增引物数及多态性引物数，并根据公式：，计算引物的多态性信息含量（PIC）及平均PIC，其中，k是一个EST
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SSR标记所检测到的等位基因的数量，P
i
是第i个等位基因的频率。以7个天门冬、5个文竹和3个蓬莱松品种为材料，检测50对EST
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SSR引物在上述近缘物种中的通用性。
[0007]（5）多态性SSR分子标记的应用：统计本专利技术首次公开的24对多态性引物在上述24份材料中的PCR扩增结果，进行亲缘关系分析。采用NTSYS
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pc 2.1软件计算各材料间的Dice遗传相似系数，在此基础上，采用非加权成对算数平均法（UPGMA）进行聚类分析，并绘制聚类图。
[0008]一组芦笋首次公开的多态性EST
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SSR分子标记，其特征在于：包括有如下24个标记所对应的核苷酸序列及正向、反向引物：
[0009]本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供的一种芦笋EST
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SSR分子标记开发方法可剔除新开发EST
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SSR引物中的非有效扩增引物，解决传统EST
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SSR分子开发方法中存在的非有效引物率偏高的问题，具有一定的创新性；（2）本专利技术开发的EST
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SSR分子标记信息更加完善，不仅具有引物序列、产物大小、
bp，退火温度为50
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65℃，GC含量维持在45%
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65%，无发卡和引物二聚体等二级结构。
[0018] （4）非有效引物的剔除及标记信息的完善：以芦笋基因组序列为模板，采用TB
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tools软件对引物质量进行批量e
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PCR检测，筛选条件为：距3'端5 bps范围内无错配碱基，总错配碱基数≤2。共剔除SSR引物14476对，其中，无扩增产物的3085对（Ⅰ类）、扩增产物条带大小严重不符的10102对（Ⅱ类），物理位置未知的1289对（Ⅲ类）；上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芦笋EST
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SSR分子标记的开发方法，其特征在于包括下列步骤：（1）Unigene序列的获得：对芦笋转录组进行Illumina高通量测序，测序数据经过滤、组装，获得Unigene数据库；（2）SSR位点鉴定及引物批量设计：采用MISA软件对Unigene序列进行SSR位点检索，采用Primer 3.0软件批量设计EST
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SSR引物；（3）非有效引物的剔除及标记信息的完善：以芦笋基因组序列为模板，采用TB
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tools软件对引物质量进行批量e
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PCR检测，筛选条件为：距3'端5 bps范围内无错配碱基，总错配碱基数≤2；符合初筛条件的引物，再经NCBI的Primer
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blast逐一e
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PCR检测，进一步剔除扩增产物存在在2个及以上与...

【专利技术属性】
技术研发人员：仪泽会，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：