蒜头果ISSR-PCR反应体系及标记方法与应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体公开一种蒜头果ISSR

【技术实现步骤摘要】
蒜头果ISSR
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PCR反应体系及标记方法与应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种蒜头果ISSR
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PCR反应体系及分子标记方法与应用。

技术介绍

[0002]蒜头果（Malania oleifera Chun et S. K Lee）为铁青树科（Olacaceae）蒜头果属（Malania）常绿乔木，是我国特有的单属种植物。蒜头果分布范围极为狭窄，其自然分布范围仅限于中国云南省的富宁、广南等地及广西省的百色右江区、巴马、凤山等地区，且其分布区域有逐渐减少的趋势，如百色、田东、马山等地区现已无蒜头果分布。由于分布范围极为狭窄且资源数量锐减，目前，蒜头果已被列为国家二级保护植物、国家珍贵用材树种以及云南省极小种群重点拯救和保护对象。
[0003]蒜头果具有极高的研究及利用价值。主要体现在：（1）其形态解剖特征兼具原始特征和进化特征，对研究铁青树科的分类有所帮助；（2）袁燕等通过分离纯化过程，从蒜头果种仁中分离得到一种新的植物毒蛋白，该毒蛋白具有抑制肿瘤细胞体外生长的作用，具有良好的抗癌药用前景；（3）从蒜头果油中提取的神经酸是大脑发育、维持的必须营养，其具有促进脑部发育、提高记忆力、防止脑神经衰老等作用。神经酸来源渠道极为有限，而蒜头果也是迄今为止发现神经酸含量最高的木本植物；（4）蒜头果种子中富含油脂，可作为合成麝香酮的理想原料，是良好的木本油料植物。有人推算，一株蒜头果一年产油价值为1.5万元。因此，蒜头果是具有广阔应用前景及极高潜在利用价值的高价值资源植物。
[0004]蒜头果作为我国特有的单属种珍稀濒危物种，其野外种群数量正在急剧减少，且人工栽培的蒜头果往往不易存活，极大程度威胁到了蒜头果种群繁衍及产业化开发利用。因此，积极开展蒜头果种质资源多样性研究，建立和优化蒜头果分子标记体系将对辅助蒜头果良种选育及构建蒜头果核心种质资源起到关键作用。近年来，蒜头果的研究工作主要集中在形态学、生理生化、蒜头果相关微生物资源研究、神经酸检测、制备及功能研究等领域，鲜见针对蒜头果遗传多样性开展系统研究的报道，亦未发现与蒜头果分子标记体系优化及应用相关的研究报道。
[0005]简单序列重复间扩增技术（Inter
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simple sequence repeat, ISSR）是在简单重复序列（Simple sequence repeat, SSR）基础上发展起来的一种分子标记技术，其具有操作简单、快速及高效的优点，因此，ISSR技术被广泛应用于不同类型植物的遗传多样性检测中。由于ISSR是一种基于PCR技术的分子标记方法，不同PCR反应体系组分配比对反应结果影响显著。此外，现有研究结果表明，不同物种的最佳ISSR
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PCR反应体系差异显著。因此，针对蒜头果建立ISSR
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PCR体系并进行优化是开展蒜头果种质资源利用的关键步骤，且该物种此前并无相关研究或方法被报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的是提供一种蒜头果ISSR
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PCR反应体系及标记方法与应用，以蒜
头果为研究对象，通过单因素试验及正交试验相结合的方法，对蒜头果ISSR
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PCR体系中的各关键因素进行综合分析，最终建立并优化蒜头果ISSR
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PCR的反应体系，为蒜头果的遗传多样性研究及种质资源保护与利用提供参考依据。
[0007]为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：蒜头果ISSR
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PCR反应体系，所述反应体系每20 μL反应体系中含有模板DNA 30 ng、引物 0.3 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1 U，所述引物为UBC825、UBC826、UBC827、UBC836、UBC844、UBC861、UBC834或UBC851中的任意一条；所述UBC825引物序列为：ACACACACACACACACT；UBC826引物序列为：ACACACACACACACACC；UBC827引物序列为: ACACACACACACACACG；UBC834引物序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGYT；UBC836引物序列为: AGAGAGAGAGAGAGAGYA；UBC844引物序列为：CTCTCTCTCTCTCTCTRC；UBC851引物序列为: GTGTGTGTGTGTGTGTYG；UBC861引物序列为：ACCACCACCACCACCACC，其中，Y代表C或T，R代表A或G。
[0008]进一步的，该反应体系形成的混合液按照如下程序进行扩增：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 sec，50.2
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56.5 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
[0009]优选的，所述UBC825引物序列的退火温度为：50.2 ℃；UBC826引物序列的退火温度为：56.5 ℃；UBC827引物序列的退火温度为：50.2 ℃；UBC836引物序列的退火温度为：56.5 ℃；UBC844引物序列的退火温度为：50.2 ℃；UBC861引物序列的退火温度为：50.2 ℃；UBC834引物序列的退火温度为：50.2 ℃；UBC851序列的退火温度为：54.0 ℃。
[0010]进一步的，本专利技术提供一种蒜头果ISSR
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PCR标记方法，包括以下步骤：（1）提取蒜头果基因组DNA并进行质量检测；（2）利用所述的蒜头果ISSR
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PCR反应体系对提取的基因组DNA进行ISSR
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PCR扩增。
[0011]本专利技术提供的蒜头果ISSR
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PCR反应体系可应用在蒜头果遗传多样性分析、种质资源鉴定及分子育种。
[0012]本专利技术达到的技术效果：本专利技术以优化后的扩增反应条件对不同引物进行退火温度筛选，探究引物的最佳退火温度，确定蒜头果ISSR
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PCR最佳反应体系为（终浓度）：20 μL反应体系中，DNA 30 ng, 引物 0.3 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U。ISSR最佳反应程序为30个循环，利用优化后的反应体系筛选出了8条引物（UBC825，UBC826，UBC827，UBC836，UBC844，UBC861, UBC834，UBC851）的最佳退火温度，依次分别为:50.2℃，56.5℃，50.2℃，56.5℃，50.2℃，50.2℃，50.2℃，54.0℃。采用优化后的反应体系及引物对3个野生分布点的10个蒜头果样品进行ISSR
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PCR分子标记检测，结果表明上述反应体系稳定可靠，不同采样点的蒜头果在遗传上相对保守，遗传多样性水平低。通过建立及优化蒜头果ISSR
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PCR体系，获得了可用于蒜头果ISSR
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PCR分子标记用的稳定体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蒜头果ISSR
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PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系每20 μL反应体系中含有模板DNA 30 ng、引物 0.3 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1 U，所述引物为UBC825、UBC826、UBC827、UBC836、UBC844、UBC861、UBC834或UBC851中的任意一条；所述UBC825引物序列为：ACACACACACACACACT；UBC826引物序列为：ACACAC ACACACACACC；UBC827引物序列为：ACACACACACACACACG；UBC834引物序列为: AGA GAGAGAGAGAGAGYT；UBC836引物序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGYA；UBC844引物序列为：CTCTCTCTCTCTCTCTRC;UBC851引物序列为: GTGTGTGTGTGTGTGTYG；UBC861引物序列为：ACCACCACCACCACCACC，其中，Y代表C或T，R代表A或G。2.根据权利要求1所述的蒜头果ISSR
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PCR反应体系，其特征在于，该反应体系形成的混合液按照如下程序进行扩增：94℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 se...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏远，王娟，童海珍，黄久妍，潘悦，朱俊琳，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：