包含展开蛋白的组合物的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于制备生物活性复合物的基本无水的组合物、所述组合物的制备方法及其用途。及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含展开蛋白的组合物的制备方法


[0001]本专利技术涉及组合物的制备方法，所述组合物又可用于快速和简单地制备具有治疗活性的生物活性复合物，特别是用于治疗肿瘤或作为抗菌剂或抗病毒剂。本专利技术还涉及治疗肿瘤和癌症的方法，特别是选择性靶向肿瘤细胞而非健康细胞的方法，以及用于这些方法的复合物和组合物。

技术介绍

[0002]人们对涉及部分展开的蛋白质和脂质的复合物的生产非常感兴趣。这些蛋白质可能与处于完全折叠状态的相应蛋白质具有截然不同的特性，尤其是生物特性。蛋白质部分展开和脂肪酸结合后获得新的有益功能是一个重要的现象，可能反映了蛋白质通过改变其构象状态和相关配体实现功能多样化的一个重要的通用途径。因此，除了mRNA转录物的可变剪接、翻译后修饰和特定结构域三级结构的变化外，先前天然蛋白质的部分展开也被认为是产生功能多样性的一种机制。这可能是由于细胞对展开蛋白和脂质辅因子的反应，该反应决定了它们特性的改变。然而，这种反应可能在例如肿瘤细胞中有所不同，这意味着它们可能会产生治疗潜力。为了形成稳定的部分，展开的蛋白质经常以某种方式被修饰，特别是可以与辅因子如脂肪酸辅因子结合。以这种方式形成的复合物可能是稳定的，并产生治疗选项。
[0003]HAMLET(杀肿瘤细胞人α
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乳清蛋白，Human alpha
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lactalbumin made lethal to tumor cells)是一类新的杀肿瘤分子家族，具有显著的特性。HAMLET由部分展开的α
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乳清蛋白形成，油酸是其不可或缺的组成部分，在研究母乳阻止细菌与细胞结合的能力时，偶然发现了HAMLET。早期的体外实验表明，HAMLET具有广泛的抗肿瘤活性和高度的肿瘤选择性，随后的治疗研究证实了HAMLET在体内的抑瘤活性和对肿瘤组织的相对选择性。在一项安慰剂对照临床研究中，局部给予HAMLET可去除或缩小皮肤乳头状瘤的大小，在膀胱癌患者中，局部滴注HAMLET会导致肿瘤细胞迅速死亡，但不会导致肿瘤周围的健康组织死亡。最近，HAMLET对膀胱癌的治疗效果在小鼠膀胱癌模型中得到证实，HAMLET治疗延缓了肿瘤的进展，并导致大鼠胶质母细胞瘤异种移植模型的生存率增加，而健康脑组织中没有细胞死亡的证据。因此，HAMLET似乎可以识别肿瘤细胞中保守的死亡途径，从而将其与健康的分化细胞区分开来。最近，HAMLET的α1H片段和油酸盐的复合物在I/II期临床试验中显示出了有前景的结果，揭示了治疗组和安慰剂组在几个疗效变量方面的显著差异。治疗也被证明是安全的，没有观察到与药物有关的副作用。
[0004]使用马溶菌酶和油酸的其他复合物也被发现会导致细胞死亡(Vukojevic等人Langmuir，2010，26(18)14782
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14787)，这表明不同的展开蛋白在与合适的辅因子偶联时会产生细胞毒性。进一步的研究涉及由油酸盐与蛋白质复合形成的生物活性复合物，包括外壳复合物，如COPI、COPII(如SAR 1)、HOPS/CORVET、SEA(Seh1
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相关)和诸如亲脂酶的网格蛋白复合物BAR结构域蛋白、以及ESCRT复合物(包括Snf7结构域亚基)。由SAR1和油酸盐形成的生物活性复合物特别令人关注(例如，参见WO 2018/116165)。
[0005]其他工作集中于也可使用的这些蛋白质肽片段的用途(参见例如EP
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B
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2643010、WO 2018/210759、WO 2018/116165和WO 2019/066409)。
[0006]通常，这些类型的复合物是按照Svensson等人(2000)的描述制备的(Proc Natl Acad Sci U.S.A.97，4221
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4226)。采用疏水相互作用色谱法从母乳中纯化天然α
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乳清蛋白。用EDTA展开蛋白质，在用油酸预处理的基质上进行离子交换色谱，并用高盐，具体为1M
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NaCl洗脱，以获得生物活性复合物。这类方法已用于从牛α
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乳清蛋白制备其他生物活性复合物，包括BAMLET，以及从重组形式的α
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乳清白蛋白形成的复合物，特别是那些没有半胱氨酸残基的复合物(如WO 2010/079362中所述)。
[0007]WO2010/131010中描述了用于这种生物活性复合物的替代制剂。在该参考文献中，BAMLET是在单相系统中制备的，其中α
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乳清蛋白在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重组，并加入油酸钠。然后将混合物加热至60℃或以上的温度，得到活性复合物。这种方法具有实施简单的优点，甚至可以在试剂盒的帮助下在临床情况下原位进行。
[0008]已经对化合物制备中使用的缓冲盐混合物的影响进行了研究，发现生产中使用的盐的确切性质会影响产品的活性(例如，参见WO 2018/210759)。这些先前描述的方法在水溶液中提供生物活性复合物，并且水溶液对于储存和运输来说并不理想。因此，在其他参考文献中，在溶液中制备生物活性复合物，然后冷冻干燥成包含生物活性复合物的干燥组合物。然后在使用前通过将冻干的复合物溶解在诸如PBS(参见例如WO2010/079362)中来重构水性制剂。
[0009]本专利技术提供了一种制备组合物的改进方法，该方法提供了简单的制造工艺并且非常适合于储存和运输。

技术实现思路

[0010]根据本专利技术，提供了一种制备组合物的方法，该方法包括组合以下物质的步骤：a)干燥的多肽，b)脂肪酸或脂质，或其药学上可接受的盐，和c)包含至少两种盐的缓冲组分，优选其中第一盐为氯化钠或氯化钾，第二盐为磷酸氢二钠或磷酸二氢钾，其中所述组合物基本无水。
[0011]本专利技术还提供了一种可通过该方法获得的组合物。本专利技术提供一种基本上无水的组合物，其包含：a)干燥多肽，b)脂肪酸或脂质，或其药学上可接受的盐，和c)包含至少两种盐的缓冲组分，优选其中第一种是氯化钠或氯化钾，第二种是磷酸氢二钠或磷酸二氢钾，其中所述组合物基本上不含与油酸或其药学上可接受的盐形成复合物的多肽。
[0012]还提供了一种由本专利技术的组合物制备生物活性复合物的方法。
[0013]本专利技术源于一个令人惊讶的发现，即只要缓冲盐符合本专利技术的规定，多肽只需简单加水即可进行精确水平的展开，从而与脂肪酸或脂质组分形成生物活性复合物。还注意到，观察到多肽在与固体缓冲组分盐的直接接触以及在水中溶解的初始状态期间出现的高浓度和浓度梯度下存在。在申请人进行的研究中，与现有技术相比，使用本专利技术的组合物获得了相当的生物活性。
[0014]与现有技术相比，一个显著的优点是在不需要冷冻干燥的情况下制备干燥组合物。冷冻干燥是一个能源密集型过程，需要多个耗时的步骤。通过规避冷冻干燥的需要，本专利技术的方法更简单、更经济，大大提高了制造工艺。与冷冻干燥技术相比，特别令人惊讶的
是，使用本专利技术的干燥组合物不会损害生物活性。冻干的组合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备组合物的方法，所述方法包括组合以下物质的步骤：a.干燥的多肽，b.脂肪酸或脂质，或其药学上可接受的盐，和c.包含至少两种盐的缓冲组分，优选其中第一盐是氯化钠或氯化钾，第二盐是磷酸氢二钠或磷酸二氢钾，其中所述组合物基本上不含水。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲组分进一步包含第三盐，所述第三盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，优选磷酸二氢钾。3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述多肽是膜干扰蛋白。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述多肽选自天然α
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乳清蛋白、SAR1或溶菌酶，或其活性片段或活性变体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述α
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乳清蛋白是人α
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乳清蛋白或牛α
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乳清蛋白。6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述活性片段或活性变体包括缺乏分子内键的多肽。7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述活性片段或活性变体是至多50个氨基酸的片段或变体。8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述活性片段包含SEQ ID NO 5至11中任一项的多肽，优选SEQ ID NO 6的多肽。9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一盐为氯化钠，所述第二盐为磷酸氢二钠。10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述脂肪酸是不饱和脂肪酸，优选C18不饱和脂肪酸酯，更优选顺式C18:1:9或C18:...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡塔里娜，
申请(专利权)人：林南制药公司，
类型：发明
国别省市：