一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用，属于多糖制备技术领域，包括以下步骤：通过对微拟球藻进行超低温冻存，以保证使用的微拟球藻在最好的状态，使用超声辅助提取和酸提法对海藻多糖进行粗提，保护多糖结构完整的同时，再使用酶

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于多糖制备
，具体地，涉及一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]微拟球藻（Microcystis）是一种生活在海洋中的大型单细胞绿藻，其多糖是该藻主要的营养物质之一。其细胞壁主要由β
‑
D
‑
甘露糖和葡萄糖组成，另外还有半乳糖和木糖等多种胞外多糖，其细胞壁的平均长度约为20
‑
30μm，厚度约为10
‑
30μm。微拟球藻多糖具有多种生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等。
[0003]人们在收集海洋藻类后，由于主要养殖在富营养化淡水池塘和湖泊中，而非在海水中，导致培养的海洋微藻具有培养物损失和质量下降的问题，且饲养过程中没有生长检测系统和控制系统，所以待用的微藻菌株总是不能处于最佳状态，还造成了运行成本的增加。此外，在提取微藻多糖的过程中，高产率的提取方法往往损伤了多糖的部分结构，在使用溶剂萃取法对多糖类物质进行萃取时，溶剂对多糖结构的损害较低，但往往需要重复多次萃取过程才能够有较好的多糖产率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用，通过对微拟球藻进行超低温冻存，以保证使用的微拟球藻在最好的状态，使用超声辅助提取和酸提法对海藻多糖进行粗提，保护多糖结构完整的同时，再使用酶
‑
溶剂萃取法，对微拟球藻多糖粗提物进行纯化，去除蛋白质和多肽杂质，保护结构的同时增加产率。再使用三氧化硫
‑
吡啶法对微拟球藻多糖进行硫酸化修饰，增加多糖的抗氧化活性，随后通过环氧氯丙烷介导的交联硫酸化微拟球藻多糖与壳聚糖交联，使得硫酸化微拟球藻多糖负载在水凝胶体系上，具有更好的生物相容性、细胞相容性和血液相容性，这为微拟球藻多糖增加了在生物医学方面的应用范围。本专利技术要解决的技术问题：本专利技术解决了培养的海洋微藻具有培养物损失和质量下降的问题，待用的微藻菌株总是不能处于最佳状态，导致成本的增加和高产率的提取方法往往损伤了多糖的部分结构，而使用溶剂萃取法对多糖类物质进行萃取时，溶剂对多糖结构的损害较低，但往往需要重复多次萃取过程才能够有较好的多糖产率的问题。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，包括以下步骤：（1）将冷冻保存的微拟球藻进行解冻，随后用无菌生理盐水进行稀释后接种到已灭菌的培养基中，进行摇床振荡培养，得到活化微拟球藻，具体步骤为：将冷冻保存的微拟球藻置于7℃的血清水浴中，解冻90秒，随后将解冻后的微拟球藻接种在试管中，使用无菌去离子水将体系稀释至10倍体积，随后在室温下以3500rpm速率离心10分钟，过滤，使用F/2培养基对沉淀进行培养，光照强度4000Lux，光暗周期为12小时：
12小时，取培养至稳定期，即得活化微拟球藻；（2）对活化微拟球藻进行超声辅助提取和酸提法对活化微拟球藻进行多糖提取，得到微拟球藻多糖粗提物，具体步骤为：A1、将活化微拟球藻在室温条件下以8000rpm速率离心10分钟，弃去上清液，使用蒸馏水洗涤3次后，以相同条件再次离心，将沉淀置于
‑
80℃低温冷冻干燥2小时，随后研磨成粉末，过80目筛，得到微拟球藻粉末；A2、将微拟球藻粉末加入去离子水中，搅拌均匀后进行超声提取，设置超声功率为100W，超声时间4秒，间隔时间4秒，超声处理20分钟，随后使用稀盐酸溶液调节体系pH值，并在恒温水浴条件下振荡提取，随后以3500rpm速率离心15分钟，取上清液在90℃恒温水浴的条件下浓缩至300mL，加入95%乙醇使得体系中乙醇浓度为30%，静置过夜后以3000rpm速率离心15分钟，取上清液再次加入95%乙醇，直至体系中乙醇浓度达到70%，以3500rpm速率离心15分钟后，留取沉淀，将沉淀冷冻干燥至恒重，即得到微拟球藻多糖粗提物；上述反应过程中，利用微拟球藻多糖不溶于高浓度醇的特点对多糖物质进行提取；（3）使用酶
‑
溶剂萃取法，对微拟球藻多糖粗提物进行纯化，得到微拟球藻多糖，具体步骤为：B1、将2.5
‑
3.0g蛋白水解酶加入100mL无菌去离子水中，搅拌均匀，得到蛋白酶溶液；向其中加入10g微拟球藻多糖粗物，使用NaOH溶液调节体系pH值为8，在50
‑
60℃恒温水浴下反应2小时，得到酶解后的微拟球藻多糖粗提物；B2、将氯仿与正丁醇溶液以4:1的体积比混合均匀，得到萃取溶剂；将酶解后的微拟球藻多糖粗提物与萃取溶剂以3：1的体积比振荡混合，振荡时间为25分钟，随后将体系置于3500rpm速率下离心15分钟，留取上清液，真空冷冻干燥，即得微拟球藻多糖；（4）使用硫酸基团对微拟球藻多糖进行修饰，冷冻干燥后，得到硫酸化微拟球藻多糖，具体步骤为：将15mL吡啶溶液加入烧杯中进行冰水浴，在搅拌条件下加入1.5g三氧化硫，随后将体系置于水浴中从室温开始加热，直至水浴温度为90℃，取出，向体系中加入0.2
‑
0.3g微拟球藻多糖，随后置于55℃恒温搅拌3小时，再使用冰水浴将其冷却至室温，使用NaOH溶液调节体系pH值为7，加入95%乙醇溶液使体系中乙醇浓度为70%，随后在4℃下静置过夜，以3500rpm速率下离心15分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得硫酸化微拟球藻多糖；上述反应过程中，使用三氧化硫
‑
吡啶法对微拟球藻多糖进行硫酸化修饰，通过将三氧化硫和吡啶置于冰浴下生成三氧化硫
‑
吡啶络合物，作为硫酸化试剂，最后通过酯化反应将硫酸基团取代多糖链中的羟基，完成多糖链上硫酸基团的引入；（5）使用壳聚糖凝胶对硫酸化微拟球藻多糖进行负载，即得一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖，具体步骤为：将KOH、LiOH和尿素溶解在去离子水中，在室温条件下搅拌至均匀，得到碱溶液；将3g壳聚糖加入97g碱溶液中，搅拌均匀，随后置于
‑
20℃下储存过夜，将冷冻得到的固体在室温下搅拌，直至体系透明，得到碱性壳聚糖溶液；将硫酸化微拟球藻多糖加入100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入3mL环氧氯丙烷和碱性壳聚糖溶液，并在冰水浴中以300rpm速率搅拌1小时，随后在0℃下以8000rpm速率离
心10分钟，随后在室温下静置过夜，即得一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖；其中，KOH、LiOH、尿素和去离子水的质量比为7：8：8：77，壳聚糖与硫酸化微拟球藻多糖的质量比为（1
‑
5）：（5
‑
9）；上述反应过程中，通过在碱性条件下，将环氧氯丙烷中的碳氯键断裂，随后与多糖链中的羟基生成了醚；同时，环氧氯丙烷中环的另一端，环氧基被打开，与另一个多糖分子中的羟基形成醚，通过环氧氯丙烷介导的交联硫酸化微拟球藻多糖与壳聚糖交联，形成了一种粘弹性的水凝胶结构。
[0006]进一步地，冷冻保存的微拟球藻由以下步骤制得：使用微型移液管将冷冻保护剂加入无菌去离子水中，得到冷冻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将冷冻保存的微拟球藻进行解冻，随后用无菌生理盐水进行稀释后接种到已灭菌的培养基中，进行摇床振荡培养，得到活化微拟球藻；（2）对活化微拟球藻进行超声辅助提取和酸提法对活化微拟球藻进行多糖提取，得到微拟球藻多糖粗提物；（3）使用酶
‑
溶剂萃取法，对微拟球藻多糖粗提物进行纯化，得到微拟球藻多糖；（4）使用硫酸基团对微拟球藻多糖进行修饰，冷冻干燥后，得到硫酸化微拟球藻多糖；（5）使用壳聚糖凝胶对硫酸化微拟球藻多糖进行负载，即得一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖。2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，冷冻保存的微拟球藻由以下步骤制得：使用微型移液管将冷冻保护剂加入无菌去离子水中，得到冷冻保护液；将微拟球藻使用无菌去离子水洗涤3次后，过滤后得到洗净的微拟球藻，随后加入冷冻保护液中，在黑暗和室温条件下混合30分钟，随后将体系置于4L氮蒸汽保温瓶中冷冻30分钟，随后浸入液氮罐中冷冻保存，即得冷冻保存的微拟球藻。3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为甲醇，冷冻保护液与微拟球藻的体积比为80：18。4.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，活化微拟球藻由以下步骤制得:将冷冻保存的微拟球藻置于7℃的血清水浴中，解冻90秒，随后将解冻后的微拟球藻接种在试管中，使用无菌去离子水将体系稀释至10倍体积，随后在室温下以3500rpm速率离心10分钟，过滤，使用F/2培养基对沉淀进行培养，光照强度4000Lux，光暗周期为12小时：12小时，取培养至稳定期，即得活化微拟球藻。5.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，微拟球藻多糖粗提物由以下步骤制得：A1、将活化微拟球藻在室温条件下以8000rpm速率离心10分钟，弃去上清液，使用蒸馏水洗涤3次后，以相同条件再次离心，将沉淀置于
‑
80℃低温冷冻干燥2小时，随后研磨成粉末，过80目筛，得到微拟球藻粉末；A2、将微拟球藻粉末加入去离子水中，搅拌均匀后进行超声提取，设置超声功率为100W，超声时间4秒，间隔时间4秒，超声处理20分钟，随后使用稀盐酸溶液调节体系pH值，并在恒温水浴条件下振荡提取，随后以3500rpm速率离心15分钟，取上清液在90℃恒温水浴的条件下浓缩至300mL，加入95%乙醇使得体系中乙醇浓度为30%，静置过夜后以3000rpm速率离心15分钟，取上清液再次加入95%乙醇，直至体系中乙醇浓度达到70%，以3500rpm速率离心15分钟后，留取沉淀，将沉淀冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁青，赵璐，吴志刚，
申请(专利权)人：日照职业技术学院，
类型：发明
国别省市：