一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。本发明专利技术的分子印迹功能膜对灵芝酸A具有优异的特异性和选择性，对灵芝酸A的电信号响应快速，且电化学响应值对灵芝酸A的浓度具有很好的线性关系。应值对灵芝酸A的浓度具有很好的线性关系。应值对灵芝酸A的浓度具有很好的线性关系。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及电化学传感领域，特别涉及一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]灵芝（Ganoderma）是一种隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属的植物子实体，又被称为“瑞草”、“仙草”，是我国一种名贵的药用真菌，其具有补气安神、益肺活血、固本扶正等多种药理和保健功效。2020年版《中华人民共和国药典》收录了赤芝（G. lucidum）和紫芝（G. sinense）为法定中药材，明朝李时珍著《本草纲目》中对灵芝的记载为：“其性味苦，平，无毒；益心气，入心充血，助心充脉，安神，益肺气，补中，增智慧，好颜色，利关节，坚筋骨，祛痰，健胃，活血。”近年来，国内外大量的研究验证了灵芝具有多种药理作用，如：抗癌、抗氧化、抗炎、保护心脏、抗肝毒性等。同时，相关研究通过多种现代分析手段确定了灵芝的主要药效成分之一是灵芝三萜。因此，对灵芝三萜类化合物的提取分离是一个非常重要的课题，研究其快速、实时、准确的分析方法，对于以灵芝三萜类化合物为评价指标的药材、制剂的质量控制和发挥药效防治相关疾病等方面都具有极为重要的意义。
[0003]灵芝三萜类化合物的基本结构由多个异戊二烯首尾相接而成，大多为四环三萜，是高度氧化的羊毛甾烷，分子量一般为400~600。近年来国内外对灵芝三萜类化合物中的灵芝酸进行了大量研究，证实了灵芝酸具有降血糖、抗癌、保肝排毒、抗炎、抗氧化等多方面的药效作用。自1982年Kubota首次从灵芝中分离得到灵芝酸A和灵芝酸B以来，目前已经分离得到的灵芝酸已有400多种，包括灵芝酸A、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸D等。近些年由于对保健品的市场监管不严，使得保健品市场混乱，侵害消费者利益的情况时有发生，同时也阻碍了这一领域的发展。其主要原因在于对标准物质方面研究不足。因此，本专利技术首先着力于灵芝中有代表性的标准物质的开发，重点考虑灵芝含量较多且不同产地差异较大的成分。而三萜类中最主要的化合物是灵芝酸A。同时参考国家药典和其他文献的资料，确定灵芝中标志性的有效成分为灵芝酸A。因此，对灵芝酸A进行准确检测和分离具有重要意义。
[0004]目前常用的灵芝酸A的分析检测方法包括液相色谱法、光谱法、质谱法和核磁波谱法等，能够提供大分子物质的含量、分子质量、组成和结构等信息，具有分离效率高、选择性好、应用范围广、技术成熟等优点。然而，这些方法仍存在一些短板，例如：反应时间长、仪器设备价格昂贵、对仪器操作技术要求高、检测成本消耗大，导致对分析过程的限制较多等。这也促进了开发创新检测分析手段，对传统检测方法进行补充与优化的相关研究。新型分子印迹生物传感器基于生物传感技术和分子印迹技术的原理，具有生物传感操作方便、灵敏度高、响应速度快和分子印迹高选择性等优点。
[0005]因此，目前急需一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜及其制备方法和应用。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术上的问题，本专利技术提供一种稳定性高、特异性强的便携式分子印迹功能膜。
[0007]本专利技术提供以下技术方案：一种快速检测灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。
[0008]进一步的，所述丝网印刷三电极以纸基为基底，所述敏感膜厚度为0.7
‑
1.3 nm，敏感膜还原氧化石墨烯直径为0.6
‑
4.5 μm，单层率为70
‑
80%，排列疏松；由敏感膜复合的所述功能膜采用差分脉冲伏安法（DPV）在铁氰化钾电解液的峰值增加60
‑
80μA。
[0009]一种制备分子印迹功能膜的方法，包括以下步骤：步骤一 组装三电极体系，以纸基为基底，工作电极为直径3mm，面积为0.071 cm2，材料为碳，对电极面积为0.050 cm2，材料为碳，参比电极面积为0.010 cm2，材料为银，将电极置于5.0 mmol
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L
‑1K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
·
L
‑1KCl的磷酸盐溶液中采用循环伏安法（CV）扫描检测，直至获得稳定的氧化还原峰，用超纯水冲洗电极并烘干；步骤二 取浓度为1 mg
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mL
‑1的还原氧化石墨烯纳米分散液，将壳聚糖溶于乙酸溶液形成壳聚糖溶液，与还原氧化石墨烯的分散液超声混合形成还原氧化石墨烯的壳聚糖溶液；将还原氧化石墨烯壳聚糖溶液滴加到电极表面，直至表面干燥；超纯水冲洗并烘干，得到敏感膜修饰电极；步骤三 将浓度比为3 : 1~6 : 1的邻苯二胺和灵芝酸A加至浓度为10 mmol
·
L
‑1，pH为7.0的磷酸盐（PBS）缓冲液中，将修饰电极置于缓冲溶液中进行电聚合，超纯水冲洗电极并烘干，得到分子印迹聚合物膜；步骤四 在乙醇水洗脱液中洗去模板分子灵芝酸A，用pH值为7.0的PBS缓冲液冲洗，得到印迹位点。
[0010]进一步的，在步骤二之前还包括步骤一a：将电极置于5.0 mmol
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L
‑1K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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‑1KCl的磷酸盐探针溶液中，进行CV扫描，直至获得稳定的氧化还原峰。
[0011]进一步的，CV扫描速度为50 mV/s，扫描电位为
‑
0.4至+0.6 V。
[0012]进一步的，在步骤二中，乙酸溶液的浓度为0.01～0.03 mol/L，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.2～0.3 mg/mL，超声时间为10～20 min；滴加后对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol
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L
‑
1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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L
‑1KCl，CV检测：电压范围
‑
0.2至+0.5 V，50 mV
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s
‑1，DPV检测：电压范围
‑
0.4至+0.6 V，50 mV
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s
‑1，DPV峰值增加为裸电极的1.8
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2倍。
[0013]进一步的，在步骤三中，电聚合的反应条件为扫描电压范围在（
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0.1~0.1 V）~（+0.7~+0.9 V）之间，扫描速率为40～60 mV
·
s
‑1，扫描圈数为8
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12个循环；得到分子印迹聚合物膜后，对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol
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1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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‑1KCl，CV检测：电压范围
‑
0.2至+0.5 V，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测灵芝三萜中灵芝酸A的便携式分子印迹功能膜，其特征在于，所述功能膜包括丝网印刷三电极，在电极表面修饰还原氧化石墨烯壳聚糖敏感膜，在所述敏感膜外侧设有聚邻苯二胺分子印迹膜，所述聚邻苯二胺分子印迹膜提供模板分子灵芝酸A的印迹位点。2.根据权利要求1所述的分子印迹功能膜，其特征在于，所述丝网印刷三电极以纸基为基底，所述敏感膜厚度为0.7
‑
1.3 nm，敏感膜还原氧化石墨烯直径为0.6
‑
4.5 μm，单层率为70
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80%，排列疏松；由敏感膜复合的所述丝网印刷三电极采用差分脉冲伏安法在铁氰化钾电解液的峰值增加60
‑
80 μA。3.制备权利要求1或2所述的分子印迹功能膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一 组装三电极体系，以纸基为基底，工作电极为直径3 mm，面积为0.071 cm2，材料为碳；对电极面积为0.050 cm2，材料为碳；参比电极面积为0.010 cm2，材料为银；将电极置于5.0 mmol
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1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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1 KCl的磷酸盐溶液中采用循环伏安法扫描检测，直至获得稳定的氧化还原峰，用超纯水冲洗电极并烘干；步骤二 取浓度为1 mg
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mL
‑1的还原氧化石墨烯纳米分散液，将壳聚糖溶于乙酸溶液形成壳聚糖溶液，与还原氧化石墨烯的分散液超声混合形成还原氧化石墨烯的壳聚糖溶液；将还原氧化石墨烯壳聚糖溶液滴加到电极表面，直至表面干燥；超纯水冲洗并烘干，得到敏感膜修饰电极；步骤三 将浓度比为3 : 1~6 : 1的邻苯二胺和灵芝酸A加至浓度为10 mmol
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L
‑1，pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，将修饰电极置于缓冲溶液中进行电聚合，超纯水冲洗电极并烘干，得到分子印迹聚合物膜；步骤四 在乙醇水洗脱液中洗去模板分子灵芝酸A，用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，得到印迹位点。4.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤二之前还包括步骤一a：将电极置于5.0 mmol
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L
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1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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1 KCl的磷酸盐探针溶液中，进行循环伏安法扫描，直至获得稳定的氧化还原峰。5.根据权利要求4所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，循环伏安法扫描速度为50 mV/s，扫描电位为
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0.4至+0.6 V。6.根据权利要求3所述的分子印迹功能膜的制备方法，其特征在于，在步骤二中，乙酸溶液的浓度为0.01～0.03 mol/L，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为0.2～0.3 mg/mL，超声时间为10～20 min；滴加后对电极进行CV和DPV检测，检测液为5.0 mmol
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1 K3[Fe(CN)6] 和0.1 mol
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1 KCl，CV检测：电压范围
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0.2至+0.5 V，50 mV
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s
‑1，DPV检测：电压范围
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0.4至+0.6 V，50 mV
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【专利技术属性】
技术研发人员：谢瑶，路子佳，张志飞，
申请(专利权)人：北京东方红航天生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：