儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供了儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒中包括了可直接利用的磁悬液、淋洗液和洗脱液；将所述磁悬液用于样本中儿茶酚胺代谢物的提取，操作简单直接，使用前不需要通过活化、平衡；且本发明专利技术对样品前处理步骤进行了优化，避免了蛋白沉淀的发生，处理步骤更加简单快速，更有利于临床样本中儿茶酚胺代谢物浓度的检测。茶酚胺代谢物浓度的检测。

【技术实现步骤摘要】
儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]儿茶酚胺类物质为一类重要的神经递质或激素物质，是正常生理过程中重要的信号介质，同时在病理过程中也出现其含量的相应变化。儿茶酚胺原型主要为肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)，其代谢物分别为变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)和3
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甲氧酪胺(3
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MT)。儿茶酚胺代谢物与原型物质相比，其半衰期更长，其性能更加稳定。
[0003]目前常见的测定血浆中儿茶酚胺代谢物的金标准是液相色谱
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串联质谱法，其前处理方式主要有固相萃取法、磁珠法。
[0004]液相色谱
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串联质谱结合了液相色谱的分离能力和质谱的定量检测能力，常用的串联质谱为三重四极杆。其检测原理为流动相携带待测物流经色谱柱，经色谱柱分离后，流出的物质先后在离子源内形成带电离子，经过四极杆的筛选后最终测定物质对应的m/z实现定量分析。液相色谱
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串联质谱检测的是物质本身，因此具有更高的特异性和灵敏度，分析时长更短，但是对样本的前处理过程要求较高。
[0005]固相萃取原理是样品基质各组分在萃取小柱或萃取板上的保留能力不同，使目标分析物保留并洗脱下来，同时去除样品基质中的杂质(干扰物)，分析物被浓缩。由于是特定性的选择对应的固相萃取小柱或萃取板，其净化程度非常之高，且减少了基质效应。但是这种方法前处理操作也比较复杂，且固相萃取板成本较高，另外通常需要借助于正压或负压以及氮吹装置，较难实现自动化。
[0006]磁珠法是近几年较为热门的前处理方法，在临床诊断领域的应用包括核酸如RNA、DNA、mRNA的扩增和检测技术、质谱分析法以及蛋白质的电/化学发光测定等。其原理是指是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良修饰后，制备成超顺磁性微球，该微球表面加以修饰的相应功能基团能与目标分析物特异性地识别和高效结合。现有磁珠法试剂盒的缺点：试剂盒在使用前，磁珠需要先活化、平衡，导致样本前处理周期长；前处理淋洗过程中有机试剂的加入与残留的样本有发生蛋白沉淀的风险。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。
[0008]本专利技术提供了提取和检测儿茶酚胺代谢物的试剂盒，其包括淋洗液、洗脱液和磁悬液，
[0009]所述洗脱液为甲酸和乙腈的混合液；
[0010]所述磁悬液的制备方法为：利用有机溶剂处理磁珠后，以磷酸盐缓冲液重悬，制得所述磁悬液；
[0011]所述有机溶剂包括甲醇和乙腈的混合液、甲醇或乙腈中的任意一种。
[0012]进一步的，本专利技术所述的试剂盒中，
[0013]所述淋洗液为甲醇溶液；
[0014]所述洗脱液中，甲酸的体积占比为0.2％～10％，优选为1％～5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％)，当甲酸体积占比过高时，会产生比较严重的溶剂效应，影响后续质谱检测的图谱峰形，在本专利技术中，优选的，甲酸和乙腈的体积比为2:98；
[0015]所述磁悬液中磁珠的浓度为5mg/mL；
[0016]所述磁悬液中的磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为30～50μm；该款磁珠粒径较大，便于后续磁吸过程中充分磁吸集中，避免在上清液中残留磁珠而堵塞色谱柱，影响后续色谱柱性能；
[0017]所述有机溶剂处理磁珠时，磁珠的浓度为1g磁珠/10mL有机溶剂；
[0018]所述有机溶剂为甲醇；
[0019]所述磷酸盐缓冲液的pH为6.5。
[0020]本专利技术中，利用磷酸盐缓冲液重悬制得所述磁悬液，磷酸盐缓冲液具有盐平衡、pH缓冲，模拟样本基质的作用，在实际应用中，可保护生物蛋白的结构及生物特性；与其他平衡液相比具有明显的优势。儿茶酚胺代谢物为碱性化合物，弱酸性的磷酸盐缓冲液有利于其离子化，且与其他缓冲液相比，利用磷酸盐缓冲液制备的磁珠前处理效果更优秀。
[0021]进一步的，本专利技术所述的试剂盒还包括内标工作液；
[0022]所述内标工作液为含有甲氧基肾上腺素
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d3、去甲变肾上腺素
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d3、3
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甲氧酪胺
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d4的盐酸水溶液。
[0023]进一步的，所述内标工作液为含有35ng/mL～45ng/mL甲氧基肾上腺素
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d3、35ng/mL～45ng/mL去甲变肾上腺素
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d3、35ng/mL～45ng/mL 3
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甲氧酪胺
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d4的盐酸水溶液。
[0024]更进一步的，所述内标工作液为含有40ng/mL甲氧基肾上腺素
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d3、40ng/mL去甲变肾上腺素
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d3、40ng/mL 3
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甲氧酪胺
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d4的0.1M盐酸水溶液。盐酸水溶液营造酸性环境，可以增强上述物质的稳定性，避免其降解。
[0025]本专利技术提供了儿茶酚胺代谢物的检测方法，其为利用本专利技术所述的试剂盒对样本进行前处理，获得前处理液后，利用液相色谱串联质谱系统对所述前处理液进行检测。
[0026]所述前处理包括：
[0027]内标工作液、样本和磁悬液经第一混匀去上清后获得混合物；
[0028]所述混合物经洗涤、淋洗后洗脱，获得所述前处理液；
[0029]所述洗涤的试剂为纯化水；
[0030]所述淋洗的试剂为淋洗液；
[0031]所述洗脱的试剂为洗脱液。
[0032]所述前处理中，
[0033]所述洗涤为混合物与洗涤液进行第二混匀；
[0034]所述淋洗为洗涤的产物与淋洗液进行第三混匀；
[0035]所述第一混匀的液面高度≤第二混匀的液面高度；混匀时间为15～60s；
[0036]所述第三混匀的液面高度≤第二混匀的液面高度；混匀时间为15～60s；
[0037]本专利技术的一些具体实施例中，为保持如上液面高度差异，
[0038]所述第一混匀的转速为1600rpm/min；混匀时间为30s；
[0039]所述第二混匀的转速为2100rpm/min；混匀时间为30s；
[0040]所述第三混匀的转速为1900rpm/min；混匀时间为30s。
[0041]本专利技术中，内标工作液、样本和磁悬液的混匀转速控制在1600rpm/min，避免磁珠粘壁或瓶盖造成损失，影响低浓度样本的检测；控制混合物与纯化水的混匀转速为2100rpm/min，控制此步液面高度(第二混匀的液面高度)≥第一混匀的液面高度，将离心管壁上残留的磁珠以及血浆样本中的蛋白洗掉，进一步降低了样本杂质的含量；淋洗液与洗涤产物的混匀转速控制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提取和检测儿茶酚胺代谢物的试剂盒，其包括淋洗液、洗脱液和磁悬液，所述洗脱液为甲酸和乙腈的混合液；所述磁悬液的制备方法为：利用有机溶剂处理磁珠后，以磷酸盐缓冲液重悬，制得所述磁悬液；所述有机溶剂包括甲醇和乙腈的混合液、甲醇或乙腈中的任意一种。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中，甲酸的体积占比为0.2％～10％。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述磁悬液中的磁珠为羧基磁珠。4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标工作液；所述内标工作液为含有甲氧基肾上腺素
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d3、去甲变肾上腺素
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d3、3
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甲氧酪胺
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d4的盐酸水溶液。5.儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，包括：利用权利要求1～4任一项所述的试剂盒对样本进行前处理，获得前处理液后，利用液相色谱串联质谱系统对所述前处理液进行检测。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述前处理包括：内标工作液、样本和磁悬液经第一混匀去上清后获得混合物；所述混合物经洗涤、淋洗后洗脱，获得所述前处理液；所述洗涤的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雪莹，申业明，刘亚娟，赵高岭，陈静，蔡克亚，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：