一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法，属于分子生物学和生物工程技术领域。所述的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌是在产原人参二醇的起始菌株ZW04BY酿酒酵母中敲除β

【技术实现步骤摘要】
一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物工程
，涉及异源合成人参皂苷Rd的重组酿酒工程菌及其构建方法，具体涉及一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]人参皂苷Rd具有保护心血管系统、保护神经系统、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、镇痛等多种药理活性，药用价值较高。人参皂苷Rd可用于肿瘤、心血管系统、肾脏衰竭及炎症等疾病治疗。目前人参皂苷Rd已经成为治疗脑卒中的国家一类候选新药，其作为新型神经保护剂的临床应用具有良好的发展前景。人参皂苷Rd的分子式如式(Ⅰ)所示。
[0003][0004]人参皂苷Rd主要的获取方式主要是从人参属植物中提取，但人参皂苷Rd在人参属植物中的含量都比较低，而人参属植物种植存在栽培周期长、连作障碍、农药及重金属残留等问题，有限的天然资源及人工栽培技术极大的限制了人参皂苷Rd的推广和应用。另外，化学合成因使用昂贵的起始原料和繁琐的合成程序而黯然失色。因此，利用合成生物学技术改造微生物生产人参皂苷Rd提供了一种最有潜力的替代方法。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌，其特征在于，在产原人参二醇的起始菌株ZW04BY酿酒酵母中敲除β
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葡萄糖苷酶EG H 1，过表达葡萄糖磷酸变位酶1、葡萄糖磷酸变位酶2和UDP
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葡萄糖焦磷酸化酶，糖基转移酶Pn 1
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31、糖基转移酶PnUGT53、糖基转移酶PnUGT50和原人参二醇合成酶PPDS；所述糖基转移酶PnUGT50的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述葡萄糖磷酸变位酶1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述葡萄糖磷酸变位酶2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述UDP
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葡萄糖焦磷酸化酶如SEQ ID NO.4所示；所述糖基转移酶Pn 1
‑
31的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述优化后的糖基转移酶PnUGT53的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；原人参二醇合成酶PPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。2.根据权利要求1所述的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母基因组中整合过表达原人参二醇至人参皂苷Rd途径中的所有基因，包括原人参二醇合成酶PPDS、糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶Pn UGT53。3.权利要求1所述的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过在产原人参二醇的起始菌株ZW04BY酿酒酵母中敲除β
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葡萄糖苷酶EG H 1，通过PCR扩增，将葡萄糖磷酸变位酶1、葡萄糖磷酸变位酶2和UDP
‑
葡萄糖焦磷酸化酶、糖基转移酶Pn 1
‑
31和糖基转移酶PnUGT53导入起始菌株ZW04BY，获得重组菌株1；(2)在重组菌株1的基础上，分别在组合型启动子TDH3+UAS
TEF1
‑
CIT1
‑
CLB2
和ADH 1启动子的控制之下，过表达密码子优化后的糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT53，获得重组菌株2；(3)将来自人参的原人参二醇合成酶基因PPDS进行酵母密码子优化，串联组合型启动子TDH3+UAS
TEF1
‑
CIT1
‑
CLB2
和G418抗性筛选标签，一起导入起始酿酒酵母重组菌株2的δ序列位点，获得重组菌株3；(4)获得的重组菌株3在摇瓶条件下进行发酵测产，获得的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌。4.根据权利要求3所述的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：(1.1)Y1
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LKG
‑
1基因盒重组载体构建：(1.1.1)以酵母菌株ZW04BY的基因组为模板，采用引物LEU(Dn)+pADH1
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F和LEU2
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R扩增获得同源臂下游片段；(1.1.2)以质粒pHDE
‑
Cas9为模板，采用引物KANMX+LEU(up)
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F和KA NMX+HindIII
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R进行PCR扩增，获得G418片段；(1.1.3)以UAS
TEF1+CIT1+CLB2
为模板，采用引物UAS+PTDH3
‑
R和UAS+KANMX
‑
F进行PCR扩增，获得UAS片段；(1.1.4)将获得的同源臂下游片段、G418片段、UAS片段为模板，采用引物Leu2
‑
up
‑
F和UAS+pTDH3
‑
R经融合PCR扩增，获得
‑
LKG
‑
1基因盒；(1.1.5)LKG
‑
1基因盒通过pEASY
‑
Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建重组载体，得到Y1
‑
LKG
‑
1基因盒重组载体；(1.2)Y1
‑
LKG
‑
2基因盒重组载体构建：
(1.2.1)以Y2
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EGH
‑
3基因盒重组载体为模板，采用引物pTDH3+UAS
‑
F和pTDH3+sPn50
‑
R进行PCR扩增，获得启动子TDH3片段；(1.2.2)以pESC
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SnyPnUGT50为模板，采用引物sPn50+EGFP
‑
R和sPn50+pTDH3
‑
F进行PCR扩增，获得SnyPn50片段；(1.2.3)以质粒pT4
‑
CMV
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GFP为模板，采用引物EGFP+sPnUGT50
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F和EGFP+tCYC1
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R进行PCR扩增，获得EGFP序列；(1.2.4)将获得的TDH3、SnyPn50、EGFP为模板，采用引物pTDH3+UAS
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F和EGFP+tCYC1
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R经融合PCR扩增，获得LKG
‑
2基因盒；(1.2.5)LKG
‑
2基因盒通过pEASY
‑
Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建重组载体，得到Y1
‑
LKG
‑
2基因盒重组载体；(1.3)Y1
‑
LKG
‑
3基因盒重组载体构建：(1.3.1)以酵母菌株ZW04BY的基因组为模板，采用引物Leu2
‑
up
‑
F和LE U2(up)+KANMX
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R扩增同源臂上游片段Leu2
‑
UP片段；(1.3.2)以酵母菌株BY4742基因组为模板，采用引物ADH1+PNUGT53
‑
F和pADH1+LEU2(Dn)
‑
R进行PCR扩增，获得ADH1片段；(1.3.3)以Y2
‑
EGH
‑
2基因盒重组载体为模板，采用引物PNUGT53+pADH1
‑
R和tCYC1+GFP
‑
F进行PCR扩增，获得PNUGT53片段；(1.3.4)将获得的PNUGT53、ADH1、Leu2
‑
UP片段为模板，采用引物tC YC1+GFP
‑
F和LEU2
‑
R经融合PCR扩增，获得LKG
‑
3基因盒；(1.3.5)LKG
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3基因盒通过pEASY
‑
Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建重组载体，得到Y1
‑
LKG
‑
3基因盒重组载体；(1.4)将所得的Y1
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LKG
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1、Y1
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LKG
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2和Y1
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LKG
‑
3基因盒重组载体质粒线性化一起转入起始菌株ZW04BY，获得重组菌株1；步骤(1.1.1)～(1.1.3)、(1.2.1)～(1.2.3)、(1.3.1)～(1.3.3)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min；步骤(1.1.4)、(1.2.4)、(1.3.4)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。5.根据权利要求3所述的生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：(2.1)Y2
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EGH
‑
1基因盒重组载体构建：(2.1.1)以酵母菌株BY4742基因组为模板，采用引物EGH1
‑
UP
‑
F和EGH1
‑
UP+pLYS2
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R进行PCR扩增，获得EGH1
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UP片段；(2.1.2)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物LYS2+pADH1
‑
R和pL YS2+EGH1
‑
UP
‑
F进行PCR扩增，获得pLYS2片段；(2.1.3)将获得的EGH1
‑
UP和pLYS2片段为模板，采用引物EGH1
‑
UP
‑
F和LYS2+pADH1
‑
R经融合PCR扩增，获得EGH
‑
1基因盒；(2.1.4)EGH
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1基因盒通过pEASY
‑
Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建重组载体，得
到Y2
‑
EGH
‑
1基因盒重组载体；(2.2)Y2
‑
EGH
‑
2基因盒重组载体构建：(2.2.1)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物ADH1+Lys2
‑
F和ADH1+Pn1
‑
31
‑
R进行PCR扩增，获得pADH1片段；(2.2.2)以三七基因组为模板，采用引物pn1
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31+ADH1
‑
F和Pn1
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31+tPGI
‑
R进行PCR扩增，获得Pn1
‑
31片段；(2.2.3)以得酵母菌株W303基因组为模板，采用引物tPGI+Pn1
‑
31
‑
F和tPGI+pTEF1
‑
R进行PCR扩增，获得tPGI片段；(2.2.4)以得酵母菌株W303基因组为模板，采用引物pTEF1+PNUGT53
‑
F和pTEF1+tPGI
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F扩增获得pTEF1片段；(2.2.5)以质粒YCplac22为模板，采用引物tCYC1+PNUGT53
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F和tCYC1+tPFK1
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【专利技术属性】
技术研发人员：林源，杨生超，张广辉，郝冰，卢迎春，王益娜，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：