一株香叶基香叶醇合成酿酒酵母工程菌的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一株香叶基香叶醇合成酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于合成生物学技术领域。本发明专利技术在染色体整合表达MVA途径基因，提高了IPP和DMAPP供给能力，并回补缺陷型基因HIS3、TRP1、LYS2、LEU2和URA3提高了菌体生物量。本发明专利技术还通过表达双拷贝PaGGPPs

【技术实现步骤摘要】
一株香叶基香叶醇合成酿酒酵母工程菌的构建及应用


[0001]本专利技术涉及一株香叶基香叶醇合成酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于合成生物学领域。

技术介绍

[0002]香叶基香叶醇(geranylgeraniol)，C
20
H
34
O，一种直链二萜化合物，具有广泛的抗病毒和抗肿瘤等生理活性，同时也可以用作胡萝卜素、紫杉醇和维生素E等合成前体。微生物因其生长周期短、化合物合成特异性强、发酵底物容易获得且成本低等优点成为合成生物学研究热点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)内源性甲羟戊酸途径的存在和成熟快速的基因编辑技术使酿酒酵母成成为了萜类化合物合成研究的热点之一。然而，如何利用酿酒酵母高效合成香叶基香叶醇仍然存在较多的技术难点。例如，通过染色体整合表达双拷贝tHMG1基因虽然增强了IPP和DMAPP供给，但IPP和DMAPP供给不足仍然限制了酿酒酵母高效合成香叶基香叶醇。同时，IPP和DMAPP供给增强的基础上，香叶基香叶基焦磷酸的合成效率可能也是一个关键限速步骤。

技术实现思路

[0003]技术问题：针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供了一种生产香叶基香叶醇的酿酒酵母工程菌；所述酿酒酵母工程菌表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和NADH依赖型HMGR基因，强化了甲羟戊酸途径基因并弱化甾醇合成途径；所述甲羟戊酸途径基因包括ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1和ERG20；所述弱化甾醇合成途径是用ERG7启动子替换ERG9启动子。
[0004]在一种实施方式中，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs
‑
ERG20和PaGGPPs
‑
DPP1；所述NADH依赖型HMGR基因为spHMGR。
[0005]在一种实施方式中，所述PaGGPPs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PaGGPPs
‑
DPP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述PaGGPPs
‑
ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述基因spHMGR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]在一种实施方式中，所述基因ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1和ERG20的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～10所示。
[0007]在一种实施方式中，所述基因PaGGPPs
‑
ERG20整合在gal80和adh6位点；所述基因PaGGPPs
‑
DPP1整合在rox1和pox1位点。
[0008]在一种实施方式中，所述甲羟戊酸途径基因是在所述酿酒酵母工程菌的染色体上整合表达。
[0009]在一种实施方式中，所述甲羟戊酸途径基因以P
GAL1
启动子调控基因表达。
[0010]在一种实施方式中，所述甲羟戊酸途径基因的拷贝数≥2。
[0011]在一中实施方式中，所述PaGGPPs
‑
ERG20和PaGGPPs
‑
DPP1基因的拷贝数为2。
[0012]在一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为出发菌株。
[0013]本专利技术还提供了所述酿酒酵母工程菌在发酵生产香叶基香叶醇中的应用。
[0014]在一种实施方式中，所述应用是将所述酿酒酵母工程菌在发酵培养基中，于28～30℃发酵至少120h。
[0015]在一种实施方式中，所述发酵培养基包括但不限于YPD或YPDD培养基。
[0016]在一种实施方式中，所述发酵过程中还进行了补料；所述补料是在初始葡萄糖消耗结束后流加葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度≤1g/L。
[0017]本专利技术还要求保护所述酿酒酵母工程菌或所述方法在生产含香叶基香叶醇或其衍生物的产品中的应用。
[0018]有益效果：本专利技术通过强化IPP和DMAPP供给，引入NADH依赖型HMGR和弱化甾醇合成途径，提高了香叶基香叶醇的合成能力，使构建获得的基因工程菌发酵120h的香叶基香叶醇达5.57g/L，是目前为止报道的最高产量，具有工业化应用前景。
附图说明
[0019]图1是本专利技术合成香叶基香叶醇的代谢途径示意图。
[0020]图2是质粒Ts
‑
LYS2
‑
tP10示意图。
[0021]图3是质粒Ts
‑
TRP1
‑
IP20示意图。
[0022]图4是质粒Ts
‑
LEU2
‑
8P19示意图。
[0023]图5是质粒Ts
‑
URA3
‑
12P13示意图。
[0024]图6是质粒Ts
‑
HIS3示意图。
[0025]图7是质粒Ts
‑
80PE示意图。
[0026]图8是质粒Ts
‑
ROX1
‑
101PD示意图。
[0027]图9是质粒Ts
‑
ADH6
‑
101P20示意图。
[0028]图10是质粒Ts
‑
POX1
‑
101PD示意图。
[0029]图11是质粒Ts
‑
HO
‑
101spH示意图。
[0030]图12是质粒Ts
‑
P
ERG7
示意图。
[0031]图13是质粒Ts
‑
P
HXT1
示意图。
[0032]图14是质粒BTS
‑
ROX1示意图。
[0033]图15是质粒BTS
‑
ADH6示意图。
[0034]图16是质粒BTS
‑
POX1示意图。
[0035]图17是质粒BTS
‑
HO示意图。
[0036]图18是质粒BTS
‑
P
ERG9
示意图。
[0037]图19是WHtES菌株角鲨烯含量检测情况。
[0038]图20是不同基因操作对工程菌合成香叶基香叶醇的影响比较。
[0039]图21是工程菌WtG
‑
10 5L发酵罐合成香叶基香叶醇情况。
具体实施方式
[0040]摇瓶种子培养基(YPD)：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，使用前115℃灭菌20min。
[0041]摇瓶发酵培养基(YPDD)：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，发酵时加
入10％十二烷(V/V)，使用前115℃灭菌20min。
[0042本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产香叶基香叶醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和NADH依赖型HMGR基因，强化了甲羟戊酸途径基因并弱化甾醇合成途径；所述甲羟戊酸途径基因包括ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1和ERG20；所述弱化甾醇合成途径是用ERG7启动子替换ERG9启动子。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs
‑
ERG20和PaGGPPs
‑
DPP1；所述NADH依赖型HMGR基因为spHMGR。3.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述基因PaGGPPs
‑
ERG20整合在gal80和adh6位点；所述基因PaGGPPs
‑
DPP1整合在rox1和pox1位点。4.根据权利要求1～3任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，王均华，李由然，朱惠霖，张梁，丁重阳，徐沙，顾正华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：