用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，涉及生物医药技术领域，该种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法包括S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs使用神经干细胞NSC培养基1制备神经球；S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：其通过采用本申请提供的一种治疗缺血性脑卒中的神经干细胞制备方法，通过对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，进一步使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗。病治疗。病治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域技术，尤其是指一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]从上世纪90年代开始，脑血管病已连续32年位居国民死亡原因之首，其中脑卒中是单病种中发病率、致残率、复发率、致死率最高的疾病。近年来，脑卒中在我国40周岁以上成年人发病率一直保持在2.0％以上，且仍在继续上升，其中缺血性脑卒中占全体病患80％以上。脑卒中患者即便得到了有效治疗，预后1年内复发率仍高达17.7％。缺血性脑卒中发生后，患者脑部因应激发生缺血性神经兴奋及过度氧化应激，大量神经细胞发生凋亡，加剧脑部炎症反应，随后破坏血脑屏障，进而引发外周淋巴细胞参与，进一步加重脑部炎症，破环神经细胞生存环境，导致脑部出现不可逆损伤。这也是导致大量患者康复后，脑部功能受损，生活难以自理的主要原因。
[0003]自2006年，诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSC)技术被发现以来，iPSC以可实现多种不同组织细胞分化的多能性，受到众多学者及研究者的关注，特别是在器官组织修复上被给予厚望。利用不同诱导方法，可以定向将iPSC分化为心肌细胞、胰岛细胞、神经细胞、角膜细胞等。其中，部分细胞分化类型已有多项临床研究证明其可靠性、安全性及有效性。iPSC分化的神经干细胞(iPSC
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derivedneuralstemcells,iNSC)，具有与内源NSC同样的生物学功能，可以向下分化多种类型的神经细胞，是一种用于组织替代修复的好材料。通过合理及规范的操作，可以高效的将iPSC分化为iNSC，这就给予了脑卒中患者在预后康复上的一种新的可能性，以iNSC作为脑卒中细胞治疗材料也逐渐步入研究者的视野。
[0004]现有技术中临床针对脑部神经细胞损伤并无有效缓解或治疗方法，仅能通过康复治疗刺激患者自我恢复。因此，迫切需要开发一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，以满足实际应用的需求。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法及其应用，其通过采用本申请提供的一种治疗缺血性脑卒中的神经干细胞制备方法，通过对诱导多能干细胞实施定向诱导分化，获得神经干细胞，进一步使用此神经干细胞进行缺血性脑卒中的疾病治疗。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下之技术方案：
[0007]一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其包括如下步骤：
[0008]S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；该培养表面为细胞培养板、细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞工厂中的任意一种，该培养的实现方式为贴壁培养；
[0009]S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；S2中的初始细胞密度为600,000个细胞/毫升；所述S2中的悬浮培养以翘板往复运动模式下悬浮培养24小时，当细胞球平均直径为100μm时进入S3进行神经球的扩增及成熟；
[0010]S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；所述S2经过48小时后进入S3，S3培养的实现方式为悬浮培养，所述S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5
°
，到达两端最低点时悬停3秒；
[0011]该NPC培养基、NSC培养基1、NSC培养基2中均包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基，所述DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基的质量比例为1：1：1.5；所述添加剂包括wnt/β
‑
catenin激动剂、GSK
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3抑制剂、ALK抑制剂、Caspase抑制剂、PERK抑制剂、ROCK2制剂、PI3K激活剂。
[0012]作为一种优选方案：所述添加剂具体包括SB431542、A83
‑
01、CHIR99021、CHIR98014、CHIR98024、740Y
‑
P、Chroman1、Emricasan、Polyamine、Trans
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ISRIB、EGF、FGF
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2、N
‑
2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
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27添加剂、非必须氨基酸添加剂(NEAA)、β巯基乙醇中的至少一种。
[0013]作为一种优选方案：所述NPC培养基中的添加剂包括N
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2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
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27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021。
[0014]作为一种优选方案：所述NSC培养基1中的添加剂包括N
‑
2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
‑
27添加剂、β巯基乙醇、SB431542、CHIR99021、EGF、FGF
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2、NEAA、β巯基乙醇。
[0015]作为一种优选方案：所述NSC培养基2中的添加剂包括N
‑
2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
‑
27添加剂、β巯基乙醇、EGF、FGF
‑
2、NEAA、β巯基乙醇。
[0016]作为一种优选方案：所述S1、S2和S3中均添加有用于提高细胞存活增殖能力的CEPT添加剂,该CEPT添加剂包括Chroman1、Emricasan、Polyamine和Trans
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ISRIB；所述S1和S2中须在培养的首个24小时内使用CEPT添加剂处理，并在24h后撤除。
[0017]作为一种优选方案：所述S1中添加有用于作为培养表面包被的添加剂以便于RONAs的形成，该作为培养表面包被的添加剂为重组人层黏连蛋白(laminin)、重组人纤连蛋白(fibronectin)或重组人玻连蛋白(Vitronectin)中的一种。
[0018]作为一种优选方案：所述S3每2天全换液一次；当神经球直径超过350μm时执行传代程序，所述执行传代程序包括：使用消化液进行消化，并按1000,000个细胞/毫升转移至新的培养容器中。
[0019]作为一种优选方案：所述S3中的传代程序最多执行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；包括如下步骤：S1、iPSC分化获得RONAs：使用神经外胚层细胞诱导NPC培养基培养iPSC分化以形成神经聚集体RONAs；该培养表面为细胞培养板、细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞工厂中的任意一种，该培养的实现方式为贴壁培养；S2、由RONAs制备神经球：将S1中形成的RONAs通过消化酶分散形成单细胞或数个细胞的集合体，使用NSC培养基1重悬后，通过悬浮培养以形成神经球；S2中的初始细胞密度为600,000个细胞/毫升；所述S2中的悬浮培养以翘板往复运动模式下悬浮培养24小时，当细胞球平均直径为100μm时进入S3进行神经球的扩增及成熟；S3、神经球扩增、成熟及制备NSC制剂：将S2中制备的神经球使用NSC培养基2培养以促进扩增和成熟；使用消化的方式将神经球完全消化成单细胞，并使用细胞冻存液，重悬细胞沉淀制备为具有神经干细胞的NSC制剂；所述S2经过48小时后进入S3，S3培养的实现方式为悬浮培养，所述S3中的悬浮培养分为两个阶段循环进行，第一阶段为静置阶段，将细胞悬液静置培养2小时，第二阶段为翘板往复运动模式下悬浮培养22小时，往复运动倾角为5
°
，到达两端最低点时悬停3秒；该NPC培养基、NSC培养基1、NSC培养基2中均包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基包括DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基，所述DMEM基础培养基、F12基础培养基和NeuralBasal基础培养基的质量比例为1：1：1.5；所述添加剂包括wnt/β
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catenin激动剂、GSK
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3抑制剂、ALK抑制剂、Caspase抑制剂、PERK抑制剂、ROCK2制剂、PI3K激活剂。2.根据权利要求1所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述添加剂具体包括SB431542、A83
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01、CHIR99021、CHIR98014、CHIR98024、740Y
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P、Chroman1、Emricasan、Polyamine、Trans
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ISRIB、EGF、FGF
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2、N
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2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
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27添加剂、非必须氨基酸添加剂、β巯基乙醇中的至少一种。3.根据权利要求2所述的用于治疗缺血性脑卒中的神经干细胞的制备方法，其特征在于；所述NPC培养基中的添加剂包括N
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2添加剂、GlutaMaxTM
‑Ⅰ
添加剂、B
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27添加剂、β巯基乙醇、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅泽钦，胡樾，王玉霞，胡隽源，蔡车国，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：