外泌体侧向层析定量检测方法、生物传感器和试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及外泌体侧向层析定量检测方法、生物传感器和试剂盒，通过结合纸质侧流条(LFS)生物传感器和表面增强拉曼光谱(SERS)的多变量光谱解混对血清外泌体进行定量分析，通过对人类血清样本中的癌症外泌体进行量化，并在多元曲线分辨

【技术实现步骤摘要】
外泌体侧向层析定量检测方法、生物传感器和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及外泌体侧向层析定量检测方法、生物传感器和试剂盒。

技术介绍

[0002]对生物液体中存在的循环生物标志物进行定量分析，通常称为液体活检，在临床上具有微创或无创诊断和管理癌症的潜力，这主要是受癌症发病率和患病率上升的推动。大量的生物材料已被用于液体活检，包括循环肿瘤细胞、循环蛋白质、无细胞核酸、代谢物和肿瘤细胞外囊泡。其中，外泌体是纳米级(30
‑
150纳米)的细胞外实体，几乎由所有类型的细胞产生，并含有从其母体细胞继承的多种关键成分，包括蛋白质、核酸、代谢物、脂质等。更重要的是，外泌体的特点是高丰度(>109颗粒/毫升)和在所有体液中的出色稳定性。这些突出的特点共同使外泌体成为了癌症无创诊断和预后的理想选择，比上述那些传统的循环生物标志物优越得多。靶向外泌体的表面膜蛋白是基于外泌体的液体活检的主要策略，在Western印迹分析、酶联免疫吸附试验、流式细胞仪以及新兴的光学和电化学方法中被广泛采用。这些方法的检测原理大多涉及单个表面外泌体生物标志物或多个外泌体生物标志物与生物识别元件(如抗体、诱导剂)的特定相互作用。然而，这些方法的检测性能由于不同来源的外泌体中蛋白质生物标志物的共同表达和它们的细微差别而受到影响。因此，直接在复杂的生物样本中对外泌体进行替代性的定量工具是迫切需要的，这能够用于微创或无创的癌症诊断。
[0003]基于外泌体的癌症诊断的理想策略是量化癌症特定的外泌体，而不是那些表面外泌体生物标志物。由于外泌体含有多种表面膜蛋白，因此可以通过其外泌体表面蛋白的线性组合来定义特定来源的单个外泌体。现有技术开发了光学和电化学生物传感平台，用于同时量化临床样本中的多种癌症特异性生物标志物，具有较高的灵敏度和出色的特异性。然而，很少有研究针对同时测定那些表达在同一外泌体上的特异性生物标志物进行量化。对临床样本中的外泌体进行量化的困难在于利用其分子特征对单个外泌体的精确定义。
[0004]拉曼光谱是强大的分析工具，可对生物样品(如外泌体)进行成分分析。它能以分子特异性、非破坏性、对水不敏感、出色的多路复用能力和较少的样品制备，对外泌体进行基于全知的分子分析。拉曼光谱的多变量光谱解混分析可以识别和量化复杂生物样品中的纯成分。事实上，多变量光谱解混分析已经成功用于确定各种高光谱图像中的分子组成和空间分布。

技术实现思路

[0005]基于现有技术存在的上述缺陷，本专利技术提供了通过结合纸质侧流条(LFS)生物传感器和多变量光谱解混分析对血清外泌体进行定量的表面增强拉曼光谱(SERS)，而不是量化外泌体蛋白。首先构建了分别来自SKBR
‑
3和MCF
‑
7乳腺癌细胞的两种不同外泌体
‑‑
SKBR和MCF外泌体的SERS光谱，然后将其作为光谱未混合辅助量化分析外泌体的基本光谱。本发
明的SERS
‑
LFS生物传感器能够对血清外泌体进行绝对定量，两种外泌体的检测极限都低至～106个颗粒/毫升。本专利技术进一步举例说明了这一策略在直接来自乳腺癌患者的血清外泌体的定量双联检测中的应用。结果发现，没有接受手术的HER2+和LuminalA型乳腺癌患者分别富含血清中的SKBR和MCF外泌体。这些乳腺癌患者的手术治疗伴随着血清中SKBR或MCF外泌体的明显减少。这些结果表明，结合SERS
‑
LFS生物传感器和多变量光谱解混技术，利用临床样本中外泌体的强大定量能力，在乳腺癌亚型分析和治疗监测方面具有巨大潜力。
[0006]本专利技术提供了定量的表面增强拉曼光谱
‑
侧流条(SERS
‑
LFS)生物传感器，通过对人类血清样本中的癌症外泌体进行量化，并在多变量光谱解混合的辅助下，对乳腺癌进行准确的无创分型和手术效果评估。本专利技术的设计主要基于单个外泌体的基本SERS光谱，用于直接对血清样品中的外泌体进行定量分析，这些光谱是由与其表面外泌体蛋白相关的SERS光谱的加权组合构建的。本专利技术方法的独特优势在于对癌症分子亚型特征的外泌体进行量化，而不是对以前报道的方法中通常实施的那些表面外泌体生物标志物进行量化。作为概念验证，选择了两种不同的乳腺癌细胞系
‑‑
SKBR
‑
3和MCF细胞，分别得出SKBR
‑
3和MCF
‑
7细胞的细胞外泌体(表示为SKBR外泌体和MCF外泌体)。SKBR
‑
3和MCF细胞显示出不同的表面外泌体蛋白HER2和MUC1的表达水平，这两种蛋白已被广泛用于模拟HER2+和LuminalA型乳腺癌亚型，两种光谱不同的SERS探针
‑‑
HER2和MUC1探针具有不同的光谱特征，被设计用来特异性地识别外泌体蛋白HER2和MUC1。单个外泌体(SKBR或MCF外泌体)的SERS光谱由HER2和MUC1探针的SERS光谱的加权总和定义。利用SERS、LFA、作为癌症生物标志物的外泌体和多变量光谱解混的巨大优势，本专利技术的方法可以对临床样本中的多个外泌体进行定量检测，具有很高的灵敏度和选择性，可用于精确的癌症诊断。
[0007]本专利技术第一方面提供了外泌体侧向层析定量检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0008]S1.构建单个外泌体的表面增强拉曼光谱：将SKBR
‑
3外泌体和MCF
‑
7外泌体分别在HER2探针和MUC1探针的等摩尔溶液中孵化，收集来自SKBR
‑
3外泌体和MCF
‑
7外泌体光谱的SERS数据集，得到两种外泌体的基谱；
[0009]S2.分别构建单个外泌体随浓度变化的标准曲线：测量不同已知浓度的单个外泌体的拉曼图谱，与外泌体基谱进行最小二乘法拟合，计算得到外泌体载荷，该载荷与外泌体浓度相关，依照载荷构建标准浓度曲线；
[0010]S3.得到待测混合样本的拉曼光谱数据集，对数据进行多元分析和光谱解混：通过多元曲线分辨
‑
偏最小二乘法拟合算法进行光谱解混，得到每种外泌体的载荷；
[0011]S4.将得到的载荷值带入到标准浓度曲线中，得到每个外泌体的实际浓度。
[0012]本专利技术选择了两个乳腺癌细胞系SKBR
‑
3和MCF
‑
7细胞来分离细胞外泌体，因为它们具有不同的分子特征，而且它们已被广泛采用来模拟HER2+和LuminalA型乳腺癌亚型。
[0013]SERS数据的多元分析和光谱解混是在MATLAB R2022a(MathWorks)上进行的。600
‑
1650厘米范围内的原始SERS数据，进行光谱预处理，去除宇宙尖峰和背景减法。首先用多变量曲线解析
‑
替代最小二乘法(MCR
‑
ALS)算法进行光谱解混，将复杂的光谱分解成具有定量贡献的纯成分光谱，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外泌体侧向层析定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：S1.构建单个外泌体的表面增强拉曼光谱：将SKBR
‑
3外泌体和MCF
‑
7外泌体分别在HER2探针和MUC1探针的等摩尔溶液中孵化，收集来自SKBR
‑
3外泌体和MCF
‑
7外泌体光谱的SERS数据集，得到两种外泌体的基谱；S2.分别构建单个外泌体随浓度变化的标准曲线：测量不同已知浓度的单个外泌体的拉曼图谱，与外泌体基谱进行最小二乘法拟合，计算得到外泌体载荷，该载荷与外泌体浓度相关，依照载荷构建标准浓度曲线；S3.得到待测混合样本的拉曼光谱数据集，对数据进行多元分析和光谱解混：通过多元曲线分辨
‑
偏最小二乘法拟合算法进行光谱解混，得到每种外泌体的载荷；S4.将得到的载荷值带入到标准浓度曲线中，得到每个外泌体的实际浓度。2.根据权利要求1所述的外泌体侧向层析定量检测方法，其特征在于，所述HER2探针和MUC1探针的构建方法具体包括：以金纳米星作为质子基底，以硅作为保护层，分别用两个不同的拉曼探针分子5,5'
‑
二硫双(2
‑
硝基苯甲酸)和4
‑
巯基苯甲酸编码，编码产物进一步分别与HER2检测适配体和MUC1检测适配体共轭，得到HER2和MUC1探针。3.根据权利要求2所述的外泌体侧向层析定量检测方法，其特征在于，所述HER2检测适配体的DNA序列为5'
‑
NH2‑
(CH2)6‑
TTTGGGCCGTCGAACACGAGCATGGTG CGTGGACCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC
‑
3'。4.根据权利要求2所述的外泌体侧向层析定量检测方法，其特征在于，所述MUC1检测适配体的DNA序列为5'
‑
NH2‑
(CH2)6‑
TTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，苏晓明，解杨岑子，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：