一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，属于微生物菌剂技术领域，所述制备方法由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中进行球磨，球磨结束得到包覆后的干粉；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10

【技术实现步骤摘要】
一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法


[0001]本公开涉及微生物菌剂
，具体涉及一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法。

技术介绍

[0002]柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种引起，对柑橘产业造成了很大经济损失。
[0003]柑橘溃疡病的发生是以老叶上病斑为传染源，当温度和空气湿度适宜时溢出，通过风雨、昆虫传播，经寄主的气孔和伤口感染柑橘幼嫩组织。因此，常规防治溃疡病的措施主要是以防治虫害，及时清园，剪除病枝病叶的方式减轻或者预防溃疡病的发生和蔓延，该方法成本高，效果无保障。药剂防治普遍采用铜制剂，其可降低累积在新叶上的菌源并减轻后续的感染，但铜制剂具有以下缺点：（1）降低了土壤和根际细菌的多样性，病原菌耐药性越来越强；（2）增加了土壤重金属污染；（3）果面光洁发亮，诱集螨类害虫，刺激螨类害虫大爆发；（4）果实铜元素超标，引发肝损伤等。
[0004]微生物农药是生物防治的重要组成部分，具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不易产生抗药性等特点，因此得到了广泛研究；目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，但是在将微生物农药用于柑橘溃疡病的防治时，存在起效慢、产品稳定性差、产品保质期短的缺点，将微生物农药加工成可湿粉剂时，加入的分散剂、润湿剂、稳定剂会对微生物农药的起效时间产生影响，而且可湿粉剂的悬浮率较低，虽然可以通过加大分散剂用量提高悬浮率，但是分散剂加入量过大，会影响微生物可湿粉剂的润湿性，还会进一步延长微生物可湿粉剂的起效时间，因此，研发一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，能够在实现起效快、产品稳定性高、产品保质期长的同时，提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性，是目前急需解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，能够在实现起效快、产品稳定性高、产品保质期长的同时，提高枯草芽孢杆菌可湿粉剂的悬浮率、润湿性。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合。
[0007]所述菌种活化的方法为，将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB固体培养基上，于32
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34℃下培养30
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32h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于34
‑
36℃培养18
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20h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为CGMCC No.24778，在专利公开号为CN115927034A，专利名称为一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的专利中已被公开；所述一级种子液制备的方法为，按照体积百分比为8
‑
10%的接种量向LB种子培养基中接入接种液，控制转速为210
‑
230rpm，温度为32
‑
34℃，摇床培养18
‑
20h后，得到一级种子液；所述二级种子液制备的方法为，按照体积百分比2
‑
4%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1
‑
1.2V／V
·
min，搅拌速度为220
‑
240rpm，培养时间为18
‑
20h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2
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2.5份葡萄糖，1.5
‑
1.8份蛋白胨，0.8
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1份酵母粉，0.6
‑
0.8份牛肉膏，0.5
‑
0.6份氯化钠，93.3
‑
94.6份去离子水；所述发酵培养的方法为，按照体积百分比为8
‑
10%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1
‑
1.2V／V
·
min，搅拌速度为220
‑
240rpm，培养时间为28
‑
30h，得到菌株发酵液；所述发酵培养基的组成，按重量份计，由以下组成：5
‑
6份葡萄糖，1.5
‑
2份蛋白胨，0.06
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0.08份酵母粉，0.2
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0.4份蛋白胨，1
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1.2份豆粕粉，0.03
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0.05份硫酸镁，0.03
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0.05份硫酸锰，0.04
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0.06份麦芽糊精，90.22
‑
92.18份去离子水；所述真空喷雾干燥的方法为，将菌株发酵液进行真空喷雾干燥，控制真空喷雾干燥的真空度为0.06
‑
0.07MPa，进风温度为110
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115℃，出风温度为60
‑
65℃，真空喷雾干燥结束得到干粉；所述干粉的芽孢率为92.7
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93.4%，发酵液活菌数为2.7
×
10
10
‑
2.9
×
10
10
CFU/mL；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中，控制球磨机的球料比为10
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15:1，球磨转速为300
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350rpm，球磨温度为25
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30℃，球磨时间为20
‑
25min，球磨结束得到包覆后的干粉；所述干粉包覆中，干粉与包覆剂的重量比为1:1.3
‑
1.5；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10
‑
12份硅藻土，6
‑
7份预糊化淀粉，2
‑
3份羟丙基甲基纤维素，1
‑
2份阳离子聚丙烯酰胺，0.1
‑
0.2份铝酸酯偶联剂DL
‑
411；所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量为300
‑
400万，离子度为10
‑
20%。
[0008]所述混合的方法为，将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂NNF混合均匀后得到初级可湿粉剂；所述混合中，包覆后的干粉、改性膨润土、改性白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂NNF的重量比为25
‑
30:10
‑
12:13
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16:3
‑
5:2
‑
3:2
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵培养、真空喷雾干燥、干粉包覆、混合；所述干粉包覆的方法为，将干粉与包覆剂加入球磨机中进行球磨，球磨结束得到包覆后的干粉；所述包覆剂的组成，按重量份计，由以下组成：10
‑
12份硅藻土，6
‑
7份预糊化淀粉，2
‑
3份羟丙基甲基纤维素，1
‑
2份阳离子聚丙烯酰胺，0.1
‑
0.2份铝酸酯偶联剂DL
‑
411；所述混合的方法为，将包覆后的干粉、膨润土、白炭黑、聚乙烯吡咯烷酮、六偏磷酸钠、二丁基萘磺酸钠、微囊化颗粒、扩散剂NNF混合均匀后得到初级可湿粉剂；所述微囊化颗粒的制备方法为：将海藻多糖、海藻酸钠、十二烷基苯磺酸钠、去离子水混合后加热至40
‑
45℃后进行搅拌，然后加入环糊精、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠，继续搅拌后进行高压均质，高压均质结束得到微囊化颗粒液，将微囊化颗粒液进行喷雾干燥，喷雾干燥结束得到微囊化颗粒；所述枯草芽孢杆菌的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为CGMCC No.24778。2.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述菌种活化的方法为，将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB固体培养基上，于32
‑
34℃下培养30
‑
32h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于34
‑
36℃培养18
‑
20h，用无菌水清洗培养基表面菌体，得到接种液。3.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述一级种子液制备的方法为，按照体积百分比为8
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10%的接种量向LB种子培养基中接入接种液，控制转速为210
‑
230rpm，温度为32
‑
34℃，摇床培养18
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20h后，得到一级种子液。4.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述二级种子液制备的方法为，按照体积百分比2
‑
4%的接种量向种子培养基中接入一级种子液，控制通气量为1
‑
1.2V／V
·
min，搅拌速度为220
‑
240rpm，培养时间为18
‑
20h，培养结束得到二级种子液；所述种子培养基的组成，按重量份计，由以下组成：2
‑
2.5份葡萄糖，1.5
‑
1.8份蛋白胨，0.8
‑
1份酵母粉，0.6
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0.8份牛肉膏，0.5
‑
0.6份氯化钠，93.3
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94.6份去离子水。5.根据权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌可湿粉剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的方法为，按照体积百分比为8
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10%的接种量向发酵培养基中接入二级种子液，控制通气量为1
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭中信，李达，王茂超，郭婧，田雪玉，李超，
申请(专利权)人：山东京青农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：