幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒的等位特异性引物，包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型；还公开了用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒和耐药性诊断的诊断试剂盒，与分析试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系，幽门螺旋菌克拉霉素耐药性检测方法，检测方法在非疾病诊断和治疗为目的的方法以及在药物的研发和/或筛选的应用，能告知病人是否同时有克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌两种菌株双重感染，提供准确临床用药信息。床用药信息。床用药信息。

【技术实现步骤摘要】
幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及医学和生物
，尤其涉及一种应用等位特异性引物检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，H.pylori)生存于人体胃部，是最常见的细菌病原体之一，世界有多半人口受到过幽门螺旋杆菌的感染。幽门螺旋杆菌感染可能引起慢性胃炎、消化性溃疡，严重者则发展为胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤。随着抗生素的广泛使用，幽门螺旋杆菌耐药菌株也在日益增多，幽门螺旋杆菌对抗生素产生耐药已经成为其根除率下降的最主要原因，这不但给临床治疗带来困难，也增加了患者的经济负担，导致医疗资源极大浪费。耐药性检测是实施个体化治疗的前提，可以避免重复使用已经产生耐药性的抗生素、并根据药敏实验选择有效抗生素。目前，已有多种检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药性的方法，传统方法检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药性主要局限于药敏试验，但E
‑
test耗材昂贵，纸片扩散法缺乏有效的判断标准，琼脂稀释法对操作技术要求较高；而且药敏试验不能鉴定H.pylori菌株基因突变的位点。另外，幽门螺旋杆菌对培养要求苛刻，微需氧条件下生长缓慢，不适合临床常规开展。如：
①
分离培养鉴定：幽门螺旋杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺旋杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，所以极易造成假阴性，其灵敏度仅有40％
‑
70％，检出率低。且幽门螺旋杆菌培养需要一定时间，不利于快速诊断。
②
UBT：根据标志物不同可分为13C
‑
UBT和14C
‑
UBT，临床应用广泛，技术要求低。缺点是费用高，易受抑酸剂和抑菌药物影响，敏感度低。
③
免疫学检查：检测粪便中幽门螺旋杆菌的抗原或血清中幽门螺旋杆菌抗体。优点是快速、无损伤，缺点是不能判断现症感染还是既往感染。
④
组织病理切片染色法：该法是把患者胃镜检查活检组织切片,染色后观察组织中的幽门螺旋杆菌。优点是可同时进行胃黏膜的病理学诊断，且特异性和敏感性均较高。但该方法受幽门螺旋杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。随着分子生物学技术的发展，PCR、荧光原位杂交、基因芯片、DNA测序等技术已被用于幽门螺旋杆菌抗生素耐药性的检测，包括：普通PCR、寡核苷酸探针杂交、基因芯片、测序等。以上所有检查方法各有特点，但均不能在一份样本中同时检测出耐药性菌株和敏感性菌株的双重感染。我们采用本公司设计的这项等位基因特异性荧光PCR技术，已发现患者同时感染幽门螺旋杆菌耐药性菌株和敏感性菌株的现象很常见（见图2中样本22和26）。
[0003]在幽门螺旋杆菌感染中，尤其在儿童幽门螺旋杆菌感染的治疗中，克拉霉素是重要的首选药物之一。然而，当前克拉霉素耐药性菌株的感染几乎占了所有幽门螺旋杆菌病人的三分之一，给临床治疗带来很大的困难，造成病情久治不愈。通过研究发现，克拉霉素的药用靶位点是幽门螺旋杆菌核糖体23S，而出现耐药性则是幽门螺旋杆菌23S基因的2142核苷酸位点上发生A to G或A to C突变，或者2143核苷酸位点上发生A to G突变。2143位点A to G突变最为常见而2142位点A to C突变引起的耐药性最强。
[0004]目前某些公司和研发机构检测上述与克拉霉素耐药相关的基因突变主是应用基
因测序和TaqMan探针法技术。基因测序能精确地得知突变基因位点，但步骤相对较多，时间长；TaqMan探针法能测出探针覆盖区域（约10个左右核苷酸）有无基因突变，但无法得知具体的突变点和突变核苷酸。倘若病人同时感染了克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌，基因测序和TaqMan探针技术均不能明确地告知。
[0005]在PCR中，扩增方向是从引物的5
’
端向3
’
端进行，引物3
’
端的第一个核苷酸是否与被扩增模板完全契合是PCR是否能开始顺畅运行的关键之一。当引物3
’
端的第一个核苷酸的模板结合位点正好位于基因上的核苷酸突变点（等位点），如果完美结合（T=A，C=G），在适当的温度条件下，则PCR能顺利地进行；倘若不完美结合（T=C，T=G，A=C，A=G），则PCR运行会大受影响。应用引物3
‘
端与基因检测位点的完美或不完美结合对PCR运行的影响设计出的PCR检测，称为基因等位特异性PCR。
[0006]目前检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药的分子生物学技术还存在费用高、临床难普及等缺点，因此，亟需开发一种快速、准确、便捷、经济的多重基因检测的方法，同步完成幽门螺旋杆菌鉴定、多位点耐药性分析，从而探索一种新的基于耐药性分析的幽门螺旋杆菌检测及个体化幽门螺旋杆菌根除模式，更好地指导临床合理应用抗生素，降低耐药菌株的出现，减少患者经济负担。现有技术还未有基于基因等位特异性PCR技术同时检测克拉霉素耐药性和幽门螺旋杆菌感染的方法。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了如下技术方案，一种幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法，应用等位特异性PCR的特点，设计了分别针对克拉霉素耐药型菌株A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）4组引物，在同样的实验条件下，通过简单的荧光定量PCR，可准确地检测出病人样本中幽门螺旋杆菌是否克拉霉素耐药性菌株、确切的基因突变位点和突变核苷酸，并能告知病人是否同时有克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌双重感染，对临床用药提供准确信息。并且本专利技术设计的等位特异性引物同时具有PCR扩增及耐药特异性位点检测作用，不需要额外设计探针。
[0008]本专利技术一方面提供了一种用于应用等位特异性引物检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，包括：引物，所述引物包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型。
[0009]作为优选的实施方式，用于检测克拉霉素耐药型菌株A2143G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；用于检测无基因突变的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示;
引物和探针序列参见表1：
[0010]作为优选的实施方式，正向引物为通用引物，反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：等位特异性引物，所述等位特异性引物包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型。2.根据权利要求1所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：用于检测克拉霉素耐药型菌株A2143G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；用于检测无基因突变的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；引物和探针序列参见表1：引物和探针序列参见表1：3.根据权利要求2所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，正向引物为通用引物，反向引物3
’
末端碱基对位于模板上的基因突变碱基或等位点；所述正向通用Tag序列为：5
’‑
AGGTGACACTATAGAATA
‑3’
，针对克拉霉素相关基因设计的引物包括4条反向引物；分别针对1个野生型基因和3个突变型基因设计。4.一种包含权利要求1
‑
3任一所述引物的用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂或用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒。5.根据权利要求4所述的分析试剂盒，其特征在于，还包括如下试剂中的任意一种或几种：qPCR缓冲液、UDGase，Taq DNA聚合酶、荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱民，唐欣，雷芙蓉，
申请(专利权)人：上海粒盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：