一种检测隐球壳菌的LAMP引物组、检测体系及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测隐球壳菌的LAMP引物组、检测体系及试剂盒，涉及生化检测技术领域。本发明专利技术所述的LAMP引物组、检测体系，可通过PCR仪、水浴锅等恒温设备直接实现对引起核桃腐烂病的病原菌隐球壳菌进行快速检测，具有快速、高效、特异性强、对设备依赖度低和便于操作的特点，该技术的实施过程可以脱离实验室，结果可视化、在基层条件下也可进行检测。在基层条件下也可进行检测。在基层条件下也可进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测隐球壳菌的LAMP引物组、检测体系及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生化检测
，具体涉及一种检测隐球壳菌的LAMP引物组、检测体系及试剂盒。

技术介绍

[0002]核桃腐烂病是一种真菌引起的病害，对核桃的危害十分严重，具体表现为该病害发生后会导致发病的枝条或树干枯死，从而造成核桃产量下降。该病害在我国各大核桃种植区均有不同程度的发生，是威胁核桃产业发展的重大病害之一。
[0003]关于核桃腐烂病病原菌的报道并不是唯一的，本专利技术所针对的对象隐球壳菌(Cryptosphaeria pullmanensis)是核桃腐烂病主要病原菌之一，该病原菌主要以菌丝、孢子、分生孢子角的形式在核桃病残枝、枯枝落叶等场所越冬，翌年从核桃组织伤口侵入核桃树体内致病。另外，经过验证，隐球壳菌对苹果和库尔勒香梨的枝条也有致病性。所以，针对隐球壳菌建立一项快速检测技术是十分有必要的。
[0004]传统的核桃腐烂病菌检测方法主要是依靠病原菌形态观察、血清学检测和分子生物学检测(PCR、实时荧光定量PCR等)。目前常用的检测方法中，传统的形态观察耗时较长，实时荧光定量PCR特异性和灵敏度都较好，但是对设备和操作人员的专业素质要求较高，所以不便于在田间基层实施检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测核桃腐烂病病原菌隐球壳菌的LAMP检测体系，可以对核桃树体内的隐球壳菌进行快速、准确的检测。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种检测隐球壳菌的LAMP引物组，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP；所述外引物F3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术还提供了一种包含如上述所述引物组的试剂盒。
[0009]优选地，所述试剂盒还包括LAMP反应液、反应酶和荧光染料。
[0010]优选地，所述反应液为2
×
Lamp MasterMix、ddH2O；反应酶为Bst DNA聚合酶；荧光染料为1000
×
SYBR GreenⅠ。
[0011]本专利技术还提供了一种隐球壳菌的LAMP检测体系，以25μL总体积LAMP反应体系计，包括如下组分：12.5μL 2
×
Lamp MasterMix、内引物FIP和BIP各1.2μL、外引物F3和B3各0.3μL、DNA模板1μL、8.0U Bst DNA聚合酶0.3μL，补充ddH2O至25μL。
[0012]优选地，所述检测体系还包括阴性对照检测体系和阳性对照检测体系。
[0013]优选地，所述两条外引物和两条内引物的摩尔浓度为8～10μmol。
[0014]本专利技术还提供了一种隐球壳菌的LAMP检测方法，包括如下步骤：以隐球壳菌的核糖体DNA为模板，用所述LAMP引物组，或所述的试剂盒，或所述的扩增体系进行LAMP扩增，通
过加入荧光染料，根据反应管内的颜色对隐球壳菌进行鉴定。
[0015]优选地，所述扩增条件为60～65℃恒温反应55～60min，75～85℃条件下反应5～10min。
[0016]优选地，所述荧光染料为SYBR GreenⅠ，若扩增产物呈浅黄色，则说明隐球壳菌成阴性，隐球壳菌未检出；若扩增产物呈荧光绿色，说明隐球壳菌呈阳性，隐球壳菌被检出。
[0017]相比现有技术，本专利技术具有如下技术效果：
[0018]本专利技术提供了一种检测核桃腐烂病病原菌隐球壳菌的LAMP引物组，经过条件优化筛选出最优条件的LAMP反应体系，同时建立了对应的检测方法。该专利技术适用于PCR仪、水浴锅等恒温设备，通过加入SYBR GreenⅠ荧光染料，可根据反应管内颜色直接实现对核桃腐烂病病原菌隐球壳菌的快速检测鉴定，具有快速、高效、特异性强、对设备依赖度低和便于操作的特点。检测极限为200fg/μL，检测灵敏度远高于常规PCR。因此，本专利技术的LAMP引物组、检测体系和检测方法适用于在田间基层检测。
附图说明
[0019]图1为引物组A的扩增结果图(从左至右依次为阴性水对照、隐球壳菌DNA模板)；
[0020]图2为引物组A特异性扩增结果(第一排从左至右依次为序号1～12核桃腐烂病其他病原菌及核桃组织内生菌样本，第二排依次为序号13～24南疆其他地区及县市的隐球壳菌样本，第三排从左至右为阴性对照和阳性对照)；
[0021]图3为引物组A温度优化电泳跑胶结果图；
[0022]图4为引物组A温度优化可视化结果图；
[0023]图5为引物组A时间优化电泳跑胶结果图；
[0024]图6为引物组A时间优化可视化结果图；
[0025]图7为引物组A灵敏度检测结果图；
[0026]图8为常规PCR灵敏度检测结果图；
[0027]图9为接种隐球壳菌的核桃苗检测结果图。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一种检测隐球壳菌的LAMP引物组，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP；所述外引物F3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本专利技术以隐球壳菌的核糖体DNA内转录间隔区为靶标序列，设计并筛选引物组，运用在线软件Primer Explorerv4，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、引物间距离来设计引物组，并使用DNAMAN软件分析设计的引物是否存在二级结构，最终筛选得到本专利技术用于检测隐球壳菌的LAMP引物组。
[0029]本专利技术还提供了一种包含如上述所述引物组的试剂盒。
[0030]在本专利技术中，所述试剂盒还包括LAMP反应液、反应酶和荧光染料。
[0031]在本专利技术中，所述反应液为2
×
Lamp MasterMix、ddH2O；反应酶为Bst DNA聚合酶；荧光染料为1000
×
SYBR GreenⅠ。
[0032]本专利技术还提供了一种隐球壳菌的LAMP检测体系，以25μL总体积LAMP反应体系计，
包括如下组分：12.5μL 2
×
Lamp MasterMix、内引物FIP和BIP各1.2μL、外引物F3和B3各0.3μL、DNA模板1μL、8.0U Bst DNA聚合酶0.3μL，补充ddH2O至25μL。本专利技术通过调整扩增体系中反应物浓度，能够明显提高扩增反应效率。
[0033]在本专利技术中，所述检测体系还包括阴性对照检测体系和阳性对照检测体系。在本专利技术的具体实施例中，阴性对照检测体系中使用ddH2O代替DNA模板进行扩增。
[0034]在本专利技术中，所述两条外引物和两条内引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测隐球壳菌的LAMP引物组，其特征在于，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP；所述外引物F3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种包含如权利要求1所述引物组的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LAMP反应液、反应酶和荧光染料。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液为2
×
Lamp Master Mix、ddH2O；反应酶为Bst DNA聚合酶；荧光染料为1000
×
SYBR GreenⅠ。5.一种隐球壳菌的LAMP检测体系，其特征在于，以25μL总体积LAMP反应体系计，包括如下组分：12.5μL 2
×
Lamp MasterMix、内引物FIP和BIP各1.2μL、外引物F3和B3各0.3μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝海婷，李猛，闫成才，代先兴，王兰，冯宏祖，杨明禄，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：