一种靶向人DMD位点的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向人DMD位点的sgRNA及其应用，属于基因编辑和细胞工程技术领域。本发明专利技术的sgRNA的靶向位点位于人DMD基因的第50号外显子区域；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术利用单碱基编辑系统中的ABE和CBE系统对HEK293T细胞中的DMD基因进行基因编辑，操作简单，编辑效率高。编辑效率高。编辑效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向人DMD位点的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑和细胞工程
，具体涉及一种靶向人DMD位点的sgRNA及其应用。

技术介绍

[0002]杜氏肌营养不良症(DMD)也称“假性肥大型肌肉萎缩症”，是最常见的一类进行性肌营养不良症，属遗传性肌肉系统疾病(ICD
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G),症状最严重的肌肉萎缩症。DMD患儿双侧腓肠肌逐渐呈假性肥大，腱反射减弱或消失。最终会发展到抬不起头，无力抬腿，更不能跳起来。脊柱弯曲也会消失。部分患者表现为行为异常。病变呈进行性加重，常到10岁时已不能行走，大多数患儿最终卧床不起，并发痉挛、褥疮、肺炎而在20岁前死亡。大多数患者会患上心脏疾病，包括扩张型心肌病，由心肌纤维化等。临床上明显的心肌病是首先体现在10岁后，会影响三分之一年龄14岁的患者，目前在所有年龄超过18岁的患者身上都有体现。临床上6岁的患儿有25％有心脏病，表现为心动过速。临床能够给予的治疗仅限于对症状的缓解：比如利用血管紧张素抑制剂来缓解心肌功能退化所带来的不适，这类药物包括配哚普利、以及多种洛尔类beta受体阻断剂。同时，随着医疗手段的提高，介入治疗也帮助缓解DMD病人的症状，这其中包括心脏循环辅助系统和呼吸辅助系统等。但是，这些治疗并无法本质性地提高DMD病人的生活质量，延长DMD病人的寿命，心脏功能的进行性退化仍旧是DMD病人致死的最主要原因。
[0003]DMD尚无有效治疗手段，目前热点的治疗方法有基因替代、外显子跳跃、基因组编辑、终止密码子通读等基因治疗。其中，CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑既能使移码突变的DMD基因恢复编码框，又能诱导外显子跳跃，还能通过基因重组纠正无义突变等。可变剪接(Alternative Splicing,AS)是在mRNA前体到成熟mRNA的过程中，不同的剪切方式使得同一个基因产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质的过程，与多种疾病相关。外显子跳跃突变(Exon Skipping,ES)是最常见的AS事件，指一个或多个外显子连同其两端的内含子一起被剪接，导致功能域/位点的丢失或开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的框移，从而引起蛋白质表达障碍。很多DMD患者在基因水平上有突变，造成DMD功能蛋白的缺失，从而导致DMD疾病的发生。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向人DMD位点的sgRNA及其应用，为研究DMD基因的治疗靶点提供新的思路和方向。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种靶向人DMD位点的sgRNA，所述sgRNA的靶向位点位于人DMD基因的第50号外显子区域；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术设计了一条靶向DMD基因的sgRNA，利用单碱基编辑系统中的ABE和CBE，将DMD基因特定外显子上影响RNA剪接的基因进行修饰，对恢复部分DMD蛋白功能有所帮助，从而提供新的DMD基因治疗靶点。
[0006]本专利技术还提供一种基于U6启动子的pU6递送载体，所述载体包含所述的sgRNA。本专利技术的pU6递送载体可与sgRNA整合在一起，将sgRNA递送到细胞发挥作用。
[0007]本专利技术还提供一种重组载体，包括所述的pU6递送载体和单碱基编辑器。
[0008]作为本专利技术所述的重组载体的优选实施方式，所述单碱基编辑器包括ABE和CBE。
[0009]作为本专利技术所述的重组载体的优选实施方式，所述单碱基编辑器包括嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因。
[0010]本专利技术还提供一种重组细胞，包括所述的重组载体。
[0011]本专利技术还提供所述sgRNA在制备用于治疗杜氏肌营养不良症的药物中的应用。
[0012]本专利技术还提供所述重组细胞在制备用于治疗杜氏肌营养不良症的药物中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种靶向人DMD位点的sgRNA。本专利技术利用单碱基编辑系统中的ABE和CBE系统对HEK293T细胞中的DMD基因进行基因编辑，操作简单，编辑效率高；本专利技术中通过改造的pU6递送载体将sgRNA递送进细胞发挥作用，可以在一定程度上提高转染效果，使基因编辑效率有所提高；本专利技术提供的sgRNA可以精准的靶向人DMD基因，可以极高的提高编辑效率，并且已经在细胞上得到验证。
附图说明
[0014]图1为实施例1的sgRNA示意图；
[0015]图2为pU6
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DMD
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50
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sgRNA表达载体示意图；
[0016]图3为pCMV
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ABEmax
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T2A
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Puro
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GFP和pCMV
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BE4max
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T2A
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Puro
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GFP表达载体示意图；
[0017]图4为Lipo8000细胞转染效果图；
[0018]图5为DMD基因编辑检测结果图。
具体实施方式
[0019]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020]实施例1靶向人DMD位点的sgRNA的构建
[0021]1、sgRNA设计
[0022]“sgRNA”，即Single guide RNA，单导向RNA，可对人DMD基因50外显子序列进行识别，协助单碱基编辑器中的ABE和CBE系统对DMD基因进行编辑。本专利技术根据sgRNA靶序列设计原则，在人DMD基因50外显子附近设计靶序列，构建1条sgRNA并将之整合进pU6载体中，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，设计流程如图1所示。
[0023]2、基于pU6递送载体的构建
[0024]将购买的pU6
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gRNA用BbsI酶切，跑胶回收后与引物退火自连产物连接，转化后挑取单克隆送到北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定，测序成功后得到pU6
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DMD
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50
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sgRNA，如图2所示；本实验室提供的ABE和CBE表达载体如图3所示。
[0025]实施例2靶向人DMD位点的sgRNA的验证
[0026]1、Lipo8000细胞转染，步骤如下：
[0027]1)提前复苏HEK293T细胞于六孔板中，待密度增长至80％，按一定密度传代至24孔板中；
[0028]2)每天观察24孔板细胞密度，密度增长至70％时即可进行转染；
[0029]3)转染前更换24孔板培养基；
[0030]4)按表1体系配置转染工作液；
[0031]5)将24孔板从培养箱取出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向人DMD位点的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶向位点位于人DMD基因的第50号外显子区域；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种基于U6启动子的pU6递送载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的sgRNA。3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述的pU6递送载体和单碱基编辑器。4.根据权利要求3所述的重组载体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：金银戈，韩东旭，周小青，郑伟，席嘉慧，宁丽，鹿璇，高月，李双鹏，吴曼虹，唐成程，邹庆剑，陈敏，江晓汕，赖良学，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：