FTO基因敲除的猪细胞系及其构建方法技术

本申请提供一种用于靶向猪细胞系的FTO基因的gRNA，以及FTO基因敲除猪细胞系的构建方法。其中所述方法包括：利用基因编辑技术，破坏猪细胞系的FTO基因的第三外显子区域。本申请设计了特异性靶向FTO基因的gRNA，利用Cas9蛋白将FTO基因的第三外显子敲除，从而达到对细胞系进行基因敲除的目的。利用本申请方法得到的FTO基因敲除的猪细胞系对细胞增殖活性没有影响，可用于研究肥胖相关疾病的致病机理，并为进一步开发针对此类疾病的治疗方式提供服务。务。

【技术实现步骤摘要】
FTO基因敲除的猪细胞系及其构建方法


[0001]本申请属于基因工程
，具体地，涉及一种FTO基因敲除的细胞系的构建方法及利用该方法构建的FTO基因敲除的猪细胞系。

技术介绍

[0002]基因编辑技术是指使用分子生物学手段对目标基因进行删除、插入、修改或替换等修饰的生物工程技术。随着研究的深入，基因编辑技术不断进步，作为第三代基因编辑技术的CRISPR/Cas9系统已应用于众多生物的基因编辑研究，CRISPR/Cas9系统是由CRISPR序列与Cas9(CRISPR associate system)两部分组成，CRISPR是一种间隔短回文序列，用于gRNA的识别结合，而Cas9具有定点切割的功能，导致目标位置的DNA双链断裂，从而实现片段敲除。
[0003]猪髋动脉内皮细胞(Pig Iliac artery Endothelial Cell，PIEC)是血管内皮的一薄层专门的上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，可控制一些物质，如白细胞进出血管等，为猪多种疾病研究提供了一种生物学相关的体外模型系统。
[0004]FTO基因被发现与人类肥胖相关，又称为肥胖基因。METTL3、PPARγ和IRX3基因为FTO的下游基因，其中METTL3表达甲基化转移酶，PPARγ表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ，IRX3为易洛魁同源盒基因3，是易洛魁同源盒基因家族成员之一。另外，FTO基因编码氧化戊二酸依赖型去甲基化核酸酶，主要在大脑中表达，参与调节饮食，同时在脂肪组织中也有表达，参与脂肪分解反应，从而维持体内脂肪能量平衡。

技术实现思路

[0005]目前尚未有猪FTO基因敲除细胞系构建的研究以及猪FTO基因敲除模型的相关研究，同时尚未有FTO基因敲除对下游基因表达量影响的研究。
[0006]本申请的目的在于提供一种FTO基因敲除的猪细胞系及其构建方法。
[0007]具体来说，本申请涉及如下方面：
[0008]1.一种用于靶向猪细胞系的FTO基因的gRNA，其中所述gRNA包含与细胞系的FTO基因的第三外显子区域互补的核苷酸序列。
[0009]2.根据项1所述的gRNA，其中所述猪细胞系为PIEC细胞系。
[0010]3.根据项1所述的gRNA，其中所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
[0011]4.一种FTO基因敲除的猪细胞系的构建方法，其中所述方法包括：
[0012]利用基因编辑技术，破坏细胞系的FTO基因的第三外显子区域。
[0013]5.根据项4所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。
[0014]6.根据项5所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
[0015]7.根据项4所述的构建方法，其中所述猪细胞系为PIEC细胞系。
[0016]8.根据项4所述的构建方法，其中针对敲除后猪细胞系进行筛选以获得敲除FTO基因的碱基导致移码突变的细胞。
[0017]9.根据项4所述的构建方法，其中用于靶向所述第三外显子区域的gRNA选自SEQ ID NO:1所示的第一gRNA、SEQ ID NO:2所示的第二gRNA、以及SEQ ID NO:3所示的第三gRNA中的一种或两种以上。
[0018]10.根据项9所述的构建方法，其中用于靶向所述第三外显子区域的gRNA为SEQ ID NO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:2所示的第二gRNA，或SEQ ID NO:1所示的第一gRNA和SEQ ID NO:3所示的第三gRNA。
[0019]11.根据项4
‑
10中任一项所述的构建方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0020]将用于靶向所述第三外显子区域的gRNA和Cas9 mRNA共同输送至PIEC细胞系；
[0021]将含有gRNA和Cas9 mRNA的细胞经过抗性筛选得到FTO基因敲除的PIEC细胞系。
[0022]12.根据项11所述的构建方法，其中将用于靶向所述第三外显子区域的gRNA和Cas9 mRNA共同输送至PIEC细胞系包括以下步骤：
[0023]将所述用于靶向所述第三外显子区域的gRNA构建到PX459载体上，将构建得到的载体转染至所述PIEC细胞系。
[0024]13.根据项12所述的构建方法，其中将所述用于靶向所述第三外显子区域的gRNA构建到PX459载体上包括以下步骤：
[0025]将第一gRNA和所述第二gRNA分别构建到PX459载体，或将所述第一gRNA和所述第三gRNA分别构建到PX459载体。
[0026]14.根据项11所述的构建方法，其中使用嘌呤霉素进行抗性筛选。
[0027]15.一种FTO基因敲除的猪细胞系，其中所述细胞系通过项4
‑
13中任一项所述的构建方法构建得到。
[0028]本申请设计了特异性靶向FTO基因的三条gRNA，利用Cas9蛋白将FTO基因的第三外显子敲除，从而达到对猪细胞系进行基因敲除的目的。利用本申请方法得到的FTO基因敲除的猪细胞系对细胞增殖活性没有影响，可用于研究肥胖相关疾病的致病机理，并为进一步开发针对此类疾病的治疗方式提供服务。
附图说明
[0029]图1为FTO基因靶点单核苷酸多态性凝胶检测结果，其中M为D2000Marker，条带分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。
[0030]图2为FTO基因敲除的猪单克隆细胞系的鉴定结果(gRNA1+gRNA2)。
[0031]图3为FTO基因敲除的猪单克隆细胞系的鉴定结果(gRNA1+gRNA3)。
[0032]图4为FTO基因敲除对细胞增殖活性的影响结果。
[0033]图5为FTO基因敲除的细胞中FTO基因下游基因mRNA的表达结果。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
[0035]除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
[0036]定义
[0037]在本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码区或非编码区本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于靶向猪细胞系的FTO基因的gRNA，其中所述gRNA包含与猪细胞系的FTO基因的第三外显子区域互补的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述猪细胞系为PIEC细胞系。3.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。4.一种FTO基因敲除的猪细胞系的构建方法，其中所述方法包括：利用基因编辑技术，破坏猪细胞系的FTO基因的第三外显子区域。5.根据权利要求4所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。6.根据权利要求5所述的构建方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9...

【专利技术属性】
技术研发人员：范柠粼，武会娟，丁晓婷，王玮，
申请(专利权)人：北京实验动物研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：