一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法技术

本发明专利技术公开了一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法。所述方法包括以下步骤：构建蛋白质酶解肽库；设置给定化合物对照组和给定化合物实验组，筛选出可以识别给定化合物的多肽探针；设置对照组和实验组，通过比较对照组和实验组谱图，找出引入多肽探针后产生上调信号的对应成分；针对产生上调信号的对应成分，进行靶向二级分析，结合碎片离子和母离子进行谱库检索，鉴定出与给定化合物作用于同一生物蛋白靶点的具有潜在毒性的活性物质分子。通过上述方法可有效降低复杂基质中大量干扰物质对毒性化合物筛查的影响，可疑信号的数量减少约90％以上，极大地提升了复杂环境中污染物的筛查效率。环境中污染物的筛查效率。环境中污染物的筛查效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法


[0001]本专利技术属于环境分析的
，更具体地，涉及一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法。

技术介绍

[0002]随着工业和社会的发展，越来越多的化学品通过各种途径排放到环境中，对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。目前，排放环境中的化合物种类繁多，而且往往以痕量水平的混合物形式存在于各种环境介质中。截至2019年止，已登记在册的化学品数量已达1.56亿，并且其中大部分化合物缺乏明确的毒理信息。此外，部分列入管控的化合物的替代品被证实具有相似的生物毒性。同时，污染物的种类和分布水平也存在着明显的区域差异。更须警惕的是，部分本身无毒或低毒的化合物可能转化成高毒性的产物，严重威胁生物种群的多样性。基于高效液相色谱和高分辨质谱的非靶向分析或可疑筛选方法被广泛应用于环境中潜在风险物质的筛查。在污染物结构准确鉴定后，结合受体、细胞和动植物体层面的毒性评估手段可以进一步明确污染物的风险程度。
[0003]作为应用广泛的传统的生物测试方法之一，效应导向分析通过色谱法或其他分离法将样品分成多种馏分进行活体毒性测试，随后对具有毒性的馏分进一步细分，反复迭代多次直至确定某个或多个可以解释大部分毒性作用的亚组分。然而，尽管EDA方法可以有效识别复杂混合物中的高风险物质，但其存在样品需求量大、成本高昂、评估周期长等问题。此外，活体生物测定的样本通量有限，评估结果易受基质成分、盐度或pH值的影响，并且在伦理道德上有所争议。
[0004]为提高风险评估效率及减少实验动物的使用，研究人员同时发展了高通量的体外实验技术用于评估和监测复杂环境样品的生态风险。美国环保署在2007年提出了ToxCast高通量筛查计划。该计划通过细胞培养等体外高通量筛查方法和计算毒理学方法对化学品进行预筛选，最后利用活体生物测试确证潜在的有毒化合物。然而，该计划优先对关注度高或应用广泛的化合物进行测试，一些尚未引起关注的污染物、以及污染物在环境中的未知转化产物往往被忽视。
[0005]因此，识别环境中的未知污染物并确证其环境风险仍存在着严重的挑战。一方面，在筛选过程中检出的大量的可疑信号给污染物的鉴定造成了极大的困难，大量的可疑信息极大地提高了准确识别高风险物质的难度，而鉴于环境中存在的污染物种类极多，优先识别出环境中风险较高的物质具有重要意义。另一方面，目前发展的毒性评估手段主要基于计算毒理学方法和生物测试，存在着成本高、耗时长、结果易受基质干扰、预测能力有限等问题。因此，发展一种快速、灵敏、经济的兼具识别结构和毒性的污染物筛查方法，将有利于提升高风险物质的筛查效率。

技术实现思路

[0006]针对上述现有的技术问题，本专利技术的首要目的在于提供一种基于蛋白质酶解肽库
的复杂基质中活性物质的筛查方法，所述筛查方法可有效降低复杂基质中大量干扰物质对毒性化合物筛查的影响，去除了大量的可疑信号，显著提升了复杂基质中具有潜在毒性的活性物质分子的筛查效率。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
[0008]一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法，包括以下步骤：
[0009]S1.蛋白质酶解肽库构建：将蛋白质溶液进行酶解处理获得多肽溶液；
[0010]S2.多肽探针筛选：采用高效液相色谱
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质谱进行检测，设置给定化合物对照组和给定化合物实验组，给定化合物对照组引入多肽溶液和对照溶液，给定化合物实验组引入多肽溶液和给定化合物溶液，筛选出前后质荷比位移等于给定化合物质量的多肽，即为多肽探针；
[0011]S3.活性物质筛查：采用高效液相色谱
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质谱进行检测，设置对照组和实验组，对照组中引入复杂基质中提取的样品溶液和对照溶液，实验组中引入复杂基质中提取的样品溶液和步骤S2中筛选获得的多肽探针，比较对照组和实验组谱图，找出实验组中引入多肽探针后产生上调信号的对应成分；其中，样品溶液中含有的活性物质与所述给定化合物作用于同一生物蛋白靶点；
[0012]S4.活性物质结构鉴定：针对步骤S3中产生上调信号的对应成分，通过高效液相色谱
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质谱进行靶向二级分析，结合碎片离子和母离子进行谱库检索，鉴定出与给定化合物作用于同一生物蛋白靶点的具有潜在毒性的活性物质分子。
[0013]专利技术人通过研究发现，污染物的毒性由其结构特征决定，识别污染物的结构特征对于预测其毒性起到重要作用。作为蛋白质的结构基础，多肽具有丰富的结构可调性。一方面，氨基酸作为基本单元为多肽的构建提供了丰富的模块，20种天然氨基酸包含了丰富的侧基类型，可针对化合物的结构特征选择不同的氨基酸构建具有立体选择性的多肽探针；另一方面，是多肽链骨架上存在大量可旋转的单键使得多肽构象调整的空间大。因此，如何合理设计具有高效选择性的分子探针成为关键。基于此，专利技术人通过蛋白质酶解构建一个包含不同侧基和不同序列长度的多肽库，通过采用特定的给定化合物，给定化合物和某些多肽形成气相复合离子后产生的显著质荷比位移使得结合有给定化合物的多肽与其他多肽区分开来，进而获得特定的多肽探针；随后在复杂基质中加入特定的多肽探针，通过对照组和实验组，找出引入多肽探针后产生上调信号的对应成分，为进一步生物毒性测试提供了关于化合物的优先次序信息，最后通过高效液相色谱
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质谱进行靶向二级分析，鉴定出与给定化合物作用于同一生物蛋白靶点的具有潜在毒性的活性物质分子。通过上述方法可有效降低复杂基质中大量干扰物质对毒性化合物筛查的影响，可疑信号的数量减少约90％以上，极大地提升了复杂环境中污染物的筛查效率，有利于减少动物实验。
[0014]优选地，所述步骤S2中，给定化合物对照组和给定化合物实验组在高效液相色谱进样处引入多肽溶液；给定化合物对照组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入对照溶液，给定化合物实验组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入给定化合物溶液。
[0015]优选地，所述步骤S3中，对照组和实验组在高效液相色谱进样处引入复杂基质中提取的样品溶液；对照组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入对照溶液，实验组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入步骤S2中筛选获得的多肽探针。
[0016]优选地，所述步骤S2和步骤S3中，在高效液相色谱和质谱的连接界面的进样速度
为20～50μL/min。更具体地，所述进样速度为25μL/min。
[0017]具体地，上述高效液相色谱为高效液相色谱(HPLC)；上述质谱为四级杆飞行时间质谱(QTOF
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MS)。此外，在实际操作中，可以通过微量注射泵和三通阀在液相色谱和质谱的连接界面处引入。
[0018]此外，在高效液相色谱进样时，通常还会引入流动相。在本申请中，所述流动相为0.1％甲酸的水溶液(水相)和0.1％甲酸的甲醇溶液(有机相)。
[0019]优选地，所述复杂基质中提取的样品溶液的提取操作为：复杂基质用滤膜过滤后，萃取，洗脱，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于蛋白质酶解肽库的复杂基质中活性物质的筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.蛋白质酶解肽库构建：将蛋白质溶液进行酶解处理获得多肽溶液；S2.多肽探针筛选：采用高效液相色谱
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质谱进行检测，设置给定化合物对照组和给定化合物实验组，给定化合物对照组引入多肽溶液和对照溶液，给定化合物实验组引入多肽溶液和给定化合物溶液，筛选出前后质荷比位移等于给定化合物质量的多肽，即为多肽探针；S3.活性物质筛查：采用高效液相色谱
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质谱进行检测，设置对照组和实验组，对照组中引入复杂基质中提取的样品溶液和对照溶液，实验组中引入复杂基质中提取的样品溶液和步骤S2中筛选获得的多肽探针，比较对照组和实验组谱图，找出实验组中引入多肽探针后产生上调信号的对应成分；其中，样品溶液中含有的活性物质与所述给定化合物作用于同一生物蛋白靶点；S4.活性物质结构鉴定：针对步骤S3中产生上调信号的对应成分，通过高效液相色谱
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质谱进行靶向二级分析，结合碎片离子和母离子进行谱库检索，鉴定出与给定化合物作用于同一生物蛋白靶点的具有潜在毒性的活性物质分子。2.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述步骤S2中，给定化合物对照组和给定化合物实验组在高效液相色谱进样处引入多肽溶液；给定化合物对照组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入对照溶液，给定化合物实验组在高效液相色谱和质谱的连接界面引入给定化合物溶液。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐剑桥，沈敏慧，温虹钰，欧阳钢锋，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：