一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法，该方法用Sephadex LH

【技术实现步骤摘要】
一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法


[0001]本专利技术属于医药
，特别涉及中药低丰度成分的高效快速获取的方法。

技术介绍

[0002]中药成分异常复杂，尽管中药中易获取的高丰度成分早已被大量报道，但其只能部分反映中药的功效。此外，中药中还藏匿着大量未知的低丰度活性成分，一般认为：中药低丰度成分是指中药提取物中含量小于0.1％的成分。它们不但具有特殊的结构特征和显著的药理活性，而且与中药功效密切关联，一直是中药创新药物的重要来源(如抗肿瘤药物长春碱和长春新碱，在长春花药材中含量分别为0.0069％和0.0013％)。但是，中药低丰度活性成分研究进展非常缓慢，究其原因存在以下关键科学问题：低丰度成分由于含量极低，难以用常规技术方法进行有效识别分离。
[0003]以延胡索为例，延胡索为罂粟科Papaveraceae紫堇属Corydalis植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，李时珍《本草纲目》中记载延胡索具有“活血，利气，止痛，通便”四大功效，2015版《中国药典》中记载延胡索味辛，苦，性温，主要用于治疗胸胁，腹腕疼痛，胸痹心痛，产后瘀阻，跌打肿痛。延胡索中的延胡索乙素、去氢紫堇碱、黄连碱、海罂粟碱、小檗碱、巴马汀、药根碱等为其主要的高丰度成分。大量研究表明，延胡索中除上述高丰度成分外，仍存在大量的低丰度成分，且多数具有较强的生物活性。
[0004]已授权的中国专利ZL201911278103公开了一种从延胡索中发现的一个生物碱二聚体类成分元胡双碱A，且具有优异的阻断PD
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1/PD
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L1相互作用活性，可用于开发成PD
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1/PD
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L1相互作用抑制剂。然而，相对于延胡索中的高丰度成分，元胡双碱A在药材中的含量极低，且存在高丰度成分和极性相似基质的严重干扰，已公开的分离方法极为繁杂，而且得到的量也极小，是目前限制该成分开展深入研究的主要原因。常规的分离方法多数需要依次使用大孔树脂、硅胶柱色谱、开放ODS柱色谱、Sephadex LH
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20、高效液相色谱等多步分离，不仅步骤繁琐，而且极易造成成分损失，化合物的获取难度大。如何能够快速高效获取该化合物，是一个亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法。
[0006]本专利技术的技术方案概述如下：
[0007]一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法，包括如下步骤：
[0008]1)将中药提取物用溶剂溶解，离心，取上清液，经Sephadex LH
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20色谱柱1进行分离，再以第一高分辨质谱仪2检测到目标成分的准分子离子峰为指导，获得含有目标成分的组分；
[0009]2)将流动相经制备型高效液相色谱仪3的二元泵4控制并通入制备型高效液相色谱仪的色谱柱6，待流动相平衡后，将含有目标成分的组分注入制备型高效液相色谱仪的色
谱柱进行分离；
[0010]3)色谱柱流出液经第一三通阀14分流成95％体积部分和5％体积部分，所述5％体积部分通入第二高分辨质谱仪7在线检测，所述95％体积部分通入制备型高效液相色谱仪的紫外检测器5检测；从所述紫外检测器流出的液体经第二三通阀15控制通入第一废液罐8；以紫外检测器检测到目标成分及第二高分辨质谱仪检测到目标成分的准分子离子峰为指导，当出现目标成分信号时，将从所述紫外检测器流出的液体经第二三通阀后，再与二元输液泵9泵入的水同时经第三三通阀16通入富集柱10，使目标成分富集在富集柱上；富集柱的流出液通过第四三通阀17通入第二废液罐11；
[0011]二元输液泵泵入的水的流速与所述95％体积部分通入制备型高效液相色谱仪的紫外检测器的流速相同；
[0012]4)重复步骤2)和步骤3)10～20次；
[0013]5)关闭制备型高效液相色谱仪，通过控制第三三通阀，二元输液泵以流速为1～4mL/min将甲醇或乙腈通过第三三通阀泵入富集柱，将目标成分进行洗脱，控制第四三通阀，洗脱液流入收集瓶12；
[0014]6)将收集瓶中的液体，干燥，得到目标成分，取部分目标成分用核磁共振波谱仪13进行检测，获取核磁共振波谱信息，确认该目标成分。
[0015]所述中药提取物优选延胡索提取物、黄连提取物、赤芍提取物、山鸡椒提取物、豨莶草提取物或香加皮提取物，还可以选用其它的中药提取物。
[0016]步骤2)所述溶剂优选为水、甲醇、乙醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液、二氯甲烷、二氯甲烷与甲醇的混合溶液。
[0017]优选的，富集柱为填充有ODS C
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填料的色谱柱。
[0018]本专利技术的优点：
[0019]本专利技术的一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法，以高分辨质谱仪跟踪锁定目标成分，即可通过简单的两步分离，实现了高丰度成分的有效去除及目标低丰度成分的高效富集与获取。
附图说明
[0020]图1为一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法示意图。
具体实施方式
[0021]本专利技术所采用的中药提取物的提取，以延胡索提取物为例，提取方法为：将中药延胡索用10倍量蒸馏水浸泡30min后，加热回流提取1h，过滤得滤液，重复提取3次，合并滤液，减压蒸干得延胡索提取物。其它的提取物如黄连提取物、赤芍提取物、山鸡椒提取物、豨莶草提取物或香加皮提取物以及其它中药提取物，也可以选用上述方法进行提取获得。
[0022]中药延胡索、黄连、赤芍、山鸡椒、豨莶草或香加皮等中药符合药典2020年版标准。
[0023]下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述,但本专利技术的实施方式不限于此。
[0024]实施例1
[0025]一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法(见图1)，包括如下步骤：
[0026]1)取30g中药提取物(以延胡索提取物为例)用80mL甲醇溶解，5000转/min离心
10min，取上清液，经Sephadex LH
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20色谱柱1(φ80mm
×
1200mm)进行分离，用甲醇洗脱，每30mL收集为一个馏分，对每个馏分用第一高分辨质谱仪2检测，再以第一高分辨质谱仪2检测到目标成分的准分子离子峰(m/z为671.2388的单电荷分子离子峰和m/z为336.1236的双电荷分子离子峰)为指导，获得含有目标成分(元胡双碱A)的组分；
[0027]2)将流动相(体积浓度40％的乙腈水溶液(含0.1％的三氟乙酸))经制备型高效液相色谱仪3(Waters 2545)的二元泵4控制(流动相流速为6mL/min)并通入制备型高效液相色谱仪的色谱柱6(色谱柱为C18 MGII(5μm,20
×
250mm))，待流动相平衡后，将含有目标成分的组分注入制备型高效液相色谱仪的色谱柱进行分离；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效获取中药低丰度成分的组合分离纯化方法，其特征是包括如下步骤：1)将中药提取物用溶剂溶解，离心，取上清液，经Sephadex LH
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20色谱柱(1)进行分离，再以第一高分辨质谱仪(2)检测到目标成分的准分子离子峰为指导，获得含有目标成分的组分；2)将流动相经制备型高效液相色谱仪(3)的二元泵(4)控制并通入制备型高效液相色谱仪的色谱柱(6)，待流动相平衡后，将含有目标成分的组分注入制备型高效液相色谱仪的色谱柱进行分离；3)色谱柱流出液经第一三通阀(14)分流成95％体积部分和5％体积部分，所述5％体积部分通入第二高分辨质谱仪(7)在线检测，所述95％体积部分通入制备型高效液相色谱仪的紫外检测器(5)检测；从所述紫外检测器流出的液体经第二三通阀(15)控制通入第一废液罐(8)；以紫外检测器检测到目标成分及第二高分辨质谱仪检测到目标成分的准分子离子峰为指导，当出现目标成分信号时，将从所述紫外检测器流出的液体经第二三通阀后，再与二元输液泵(9)泵入的水同时经第三三通阀(16)通入富集柱(10)，使目标成分富集在富集柱上；富集柱的流出液通过第四三通...

【专利技术属性】
技术研发人员：林生，夏桂阳，王玲燕，夏欢，武玉卓，
申请(专利权)人：北京中医药大学东直门医院，
类型：发明
国别省市：