一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法与应用技术

本发明专利技术适用于细胞外囊泡富集及分选领域，提供了一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法与应用，通过对无机载玻片材料进行改性，使两亲性超分子探针结合在载玻片表面，用于细胞外囊泡的捕获。使用光刻胶蚀刻系统对另一载玻片塑形形成通道，与两亲性超分子探针修饰阵列芯片组装形成具有集细胞外囊泡富集与分选一体化的操作平台，并实现针对相应疾病的原位检测。两亲性超分子探针对载玻片进行改性，对细胞外囊泡进行特异性捕获。辅助利用具有不同曲率半径通道的载玻片，对粒径不同的细胞外囊泡进行分选。该方法对操作条件要求较低，富集到的细胞外囊泡具有完整形貌，且具有较高的富集效率，可以实现原位检测相应的疾病标志蛋白。可以实现原位检测相应的疾病标志蛋白。可以实现原位检测相应的疾病标志蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法与应用


[0001]本专利技术属于细胞外囊泡富集及分选领域，尤其涉及一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]所有的细胞在生理或病理条件下都会释放细胞外囊泡(Extracellularvesicles，EVs)，其粒径大小从50nm至5000nm不等，细胞外囊泡根据生物合成或释放的粒径大小可分为细胞外囊泡(50nm
‑
150nm)、微囊泡(100nm
‑
1000nm)和凋亡小体(100nm
‑
5000nm)，其内容物包含多种蛋白质、脂质、microRNAs、mRNAs等。细胞外囊泡因其来源不同而具有异质性，因此可以反应其母体细胞的生理状态。细胞外囊泡在红细胞成熟、抗原呈递、癌症转化、物质运输、细胞间信息交流中起重要作用，这一发现为医学的治疗与诊断的应用研究带来了希望。
[0003]常见的根据细胞外囊泡尺寸进行分离的技术包括传统的凝胶色谱法、超滤法、超速离心法以及新兴的微流控技术等。超速离心法可分离出纯度较高的尺寸介于50nm
‑
200nm间的细胞外囊泡，而其他尺寸(200nm以上)的细胞外囊泡和其他物质(如：粘蛋白、脂质、糖类等)混杂在一起，造成纯度低、分离困难等问题。凝胶色谱法利用多孔介质对不同大小(粒径)的细胞外囊泡的排阻能力差异对其进行分离，分离效果较好，但分离过程中的径向剪切作用会造成细胞外囊泡的破裂，导致分离所得细胞外囊泡内容物释放，研究价值下降。超滤法利用滤膜孔径不同对细胞外囊泡进行分离，但过滤时外加推动力较大(0.1MPa
‑
0.5MPa)，易引起囊泡破裂、此外过滤时的浓差极化现象会堵塞滤膜，使分离过程无法持续进行，不利于细胞外囊泡的分离。
[0004]近年来微流控技术凭借其检测微型化、高灵敏度、更优的分析性能，在生命科学领域迅速发展，有着广泛的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法与应用，旨在解决从足够数量和纯度的细胞外囊泡中按照粒径大小差异分离出细胞外囊泡、微囊泡、凋亡小体并针对分离出的细胞外囊泡进行疾病抗原检测的问题。
[0006]不同蚀刻半径的载玻片的制备，包括如下步骤：
[0007]1)对载玻片湿法清洗、去离子水冲洗后进行脱水烘焙。
[0008]2)使用六甲基二硅氮烷(HMDS)对载玻片涂底，使载玻片表面具有疏水性，增强基底表面与光刻胶的结合。
[0009]3)使用光刻胶(如：HSQFox
‑
15/16系列等，根据蚀刻曲率半径选择光刻胶种类)涂布处理后的载玻片。
[0010]4)对载玻片软烘(85～120℃、30～60s)，使用Auto
‑
CAD设计狭缝半径(与光刻胶种类有关)为5cm，激光蚀刻，形成多条平行的通道。
[0011]5)对载玻片后烘(110～130℃,，1min)，利于后续光刻胶的清除。
[0012]6)然后使用显影液四甲基氢氧化铵(TMAH)溶解狭缝部分的光刻胶，形成多条通道。
[0013]两亲性超分子探针修饰阵列芯片的制备，包括如下步骤：
[0014]1)另选一块尺寸材质相同的载玻片，使用等离子表面处理仪对载玻片进行亲水处理，使用氮气将载玻片吹干。
[0015]2)将蚀刻后的载玻片放入真空干燥器中，滴入20ml3
‑
氨丙基三甲氧基硅烷，将干燥器抽真空，置于70℃，载玻片表面形成3
‑
氨丙基三甲氧基硅烷单层膜；
[0016]3)用乙醇洗涤载玻片，在氰基硼氰化钠的作用下，向10ml反应溶液中加入戊二醛，将载玻片表面氨基转化为醛基，其反应溶液的浓度为甲醇:乙酸＝125:1，室温下反应3h，反应完成后用反应溶液洗涤3次，再弃掉上清液；
[0017]4)配置含有氰基硼氰化钠的反应溶液，溶剂为甲醇:乙酸＝125:1，加入聚乙烯亚胺(PEI)，与载玻片在室温下反应，载玻片用甲醇洗涤后室温干燥；
[0018]5)将AMB溶解于二甲基亚砜中，超声促进溶解，并将1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺溶解于2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸缓冲液中；
[0019]6)将步骤5)中所得到的两种溶液在37℃下混合搅拌，活化羧基；
[0020]7)将步骤6)中合成的溶液活化完成后，与步骤4)所得的PEI改性载玻片在室温下反应过夜，再使用2
‑
吗啉代乙磺酸缓冲液和水洗涤，在室温环境中干燥备用；
[0021]两亲性超分子探针修饰阵列芯片对体液中细胞外囊泡的分选与检测，包括如下步骤(以血浆样本为例)：
[0022]1)将血浆样本置于4℃融化，5000g离心10min，上清用PBS缓冲液1：50稀释。
[0023]2)使用微流控技术，将血浆样本通过有分选狭缝的两亲性超分子探针修饰的阵列芯片，控制流速与流通时间。
[0024]3)用PBS缓冲液洗涤，控制流速与时间。
[0025]4)使用200mM三乙胺溶液进行洗脱，控制流速与时间，对不同直径狭缝捕获到的细胞外囊泡分别进行洗脱，利用两亲性超分子探针与细胞外囊泡的磷脂双分子层膜进行分子间相互作用，从而实现捕获。
[0026]5)将洗脱下来的不同粒径范围的细胞外囊泡分别进行收集，真空冻干，并复溶于PBS缓冲液中。
[0027]6)利用纳米流式细胞仪对洗脱下来的细胞外囊泡的浓度与纯度进行检测。
[0028]相较于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
[0029]双亲性超分子能够插入到单层膜内部与脂质和甾醇结合，利用超分子的多价协同效应，实现了对细胞外囊泡的高效捕获，这种新的策略可以结合载玻片对体液样本中的细胞外囊泡进行捕获，同时利用蚀刻的不同曲率半径的通道对细胞外囊泡进行分选；也可以针对细胞外囊泡中具有表达差异的不同的疾病标志蛋白对大批量样本进行高通量检测；该超分子探针分析手段操作简便、灵敏度高、分析速度快，有望成为细胞外囊泡高通量富集、分选和检测的新平台，为疾病的预警和追踪提供有力的技术支持。
附图说明
[0030]图1：两亲性超分子探针修饰阵列芯片捕获细胞外囊泡的荧光检测图像；
[0031]图2：对患者体液样本细胞外囊泡进行标志抗原的高通量筛选图像。
具体实施方式
[0032]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0033]以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。
[0034]实施例1：
[0035]两亲性超分子探针修饰阵列芯片富集细胞外囊泡(以血浆为例)：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种两亲性超分子阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①
应用光刻胶和显影液对载玻片进行蚀刻，设计具有不同曲率半径狭缝的载玻片；
②
制备两亲性超分子探针修饰的阵列芯片；
③
将步骤
①
与步骤
②
所得的两块修饰载玻片的修饰面相对组合。2.根据权利要求1所述的两亲性超分子阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的不同曲率半径狭缝的载玻片的制备方法包括如下步骤：1)对载玻片湿法清洗和去离子水冲洗后进行脱水烘焙；2)使用六甲基二硅氮烷对载玻片涂底；3)使用光刻胶涂布处理后的载玻片；4)对载玻片软烘，设计狭缝曲率半径为5cm，激光蚀刻，形成多条平行的通道；5)对载玻片后烘；6)使用显影液四甲基氢氧化铵溶解狭缝部分的光刻胶，形成多条通道。3.根据权利要求2所述的两亲性超分子阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述两亲性超分子探针修饰的阵列芯片的制备方法包括如下步骤：1)另选一块尺寸材质相同的载玻片，使用等离子表面处理仪对载玻片进行亲水处理，使用氮气将载玻片吹干；2)将载玻片放入真空干燥器中，滴入20ml 3
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氨丙基三甲氧基硅烷，并将干燥器抽真空，置于70℃，在载玻片表面形成3
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氨丙基三甲氧基硅烷单层膜；3)用乙醇洗涤载玻片，在氰基硼氰化钠的作用下，向10ml反应溶液中加入戊二醛，将载玻片表面氨基转化为醛基，其反应溶液的浓度为甲醇:乙酸＝125:1，室温下反应3h，反应完成后用反应溶液洗涤3次，再弃掉上清液；4)配置含有氰基硼氰化钠的反应溶液，溶剂为甲醇:乙酸＝125:1，加入聚乙烯亚胺，使其与载玻片在室温下反应，然后载玻片用甲醇洗涤后室温干燥；5)将AM...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡良海，张恺夫，申奥，王跻亮，冯馨，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：