一种异质性耐药菌的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种异质性耐药菌的检测方法，属于异质性耐药检测技术领域。本发明专利技术提供的异质性耐药菌的检测方法，是将菌液与EZMTT溶液混合，再分别加入系列浓度梯度的抗生素中培养，得到菌在不同浓度抗生素溶液中的培养液，测定所述培养液在450nm和630nm处的吸光度，绘制药敏生长率曲线。若450nm处的药敏生长率曲线和630nm处的药敏生长率曲线中，若菌生长抑制率为80％时所对应的抗生素浓度相同，则判断为非异质性耐药菌；若不相同，而且630nm处的药敏生长率曲线中，最高非抑菌浓度与最低80％抑菌浓度之间相差8倍以上，则判断为异质性耐药菌。性耐药菌。性耐药菌。

【技术实现步骤摘要】
一种异质性耐药菌的检测方法


[0001]本专利技术涉及异质性耐药检测
，尤其涉及一种异质性耐药菌的检测方法。

技术介绍

[0002]细菌或真菌的异质性耐药(heteroresistance)通常是指某个细菌或真菌培养的群体中存在着对某种药物敏感性不同的一个或多个亚群，与主要群体相比，它们表现出增加的耐药性。也即有些菌细胞对药物敏感，而另一些菌细胞则存在耐药性，这时便称这样的菌为这种药物的异质性耐药菌株。
[0003]异质性耐药有2种类型，多克隆异质性耐药(Polyclonal heteroresistance)和单克隆异质性耐药(Monoclonal heteroresistance)，它们的来源和产生机制不同。多克隆异质性耐药是由混合感染或罕见耐药突变引起的，在敏感的细菌群体中，在抗生素治疗过程中其比例缓慢增加。该类型的异质性耐药现象只能在群体中才能检测到。单克隆异质性耐药存在于纯的菌落中，纯菌落中含有频繁自发的耐药细菌亚群。在没有抗生素压力(单菌落型异质性耐药)的情况下，一个菌落在高频率下分化为两个种群(敏感和耐药)。在这种情况下，来自纯菌落的纯培养显示出异质性耐药表型。
[0004]异质性现象已经在多种临床致病菌中出现，目前出现异质性耐药的细菌有阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等。细菌异质性耐药的抗生素主要有碳青霉烯类(亚胺培南和培南)、多粘菌素类等。除此之外，异质性现象还经常出现在万古霉素，如金黄色葡萄球菌对万古霉素的异质性耐药现象。
[0005]由于异质性耐药的特殊性，临床上的一些常规药敏检测方法无法检测出来，如VITEK法。目前，比较公认的异质性耐药的检测方法主要有浓度梯度法(E
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test法)、纸片扩散法(Disk Diffusion)和菌群谱分析法(Population analysis profile，PAP)。
[0006]在E
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test法、纸片扩散法中，将在抑菌圈中有明显散在生长的菌落判定为异质性耐药现象，如图1所示。该方法试验步骤就是常规的药敏检测方法，且操作简单，但是该方法对异质性耐药的检测特异性比较低，容易出现假阳性。
[0007]菌群谱分析法是检测异质性耐药表型的金标准方法。该法首先需要制备一系列2倍梯度浓度的抗生素溶液，将其分别与洁净培养基混合均匀后倒平板，从而获得含一系列梯度浓度的抗生素平板。再将单菌落用生理盐水稀释至0.5麦氏浊度(McF)，再依次10倍稀释成一系列梯度浓度菌液，分别取不同菌液至相应浓度抗生素平板中涂布，于培养箱中37℃培养48小时后，对菌落数进行计数，实际菌落数由之换算即得。最后以抗生素浓度为横坐标，实际菌落数以10为底的对数为纵坐标作图，若细菌在最高非抑菌浓度(抑菌率0％)到最低完全抑菌浓度(抑菌率为100％)之间大于8倍关系则可以证实为异质性耐药，如图2所示(图1和图2均来源于Xiaojiong Jia,Weijia Ma,Jianchun He,Xiaolang Tian,Hang Liu,Hua Zou,Si Cheng.Heteroresistance to cefepime in Pseudomonas aeruginosa bacteraemia[J].International Journal of AntimicrobialAgents,2020,55(3):)。但由于该方法筛选的盲目性大，试验步骤繁琐、流程长，且需手工操作，不易在临床推广使用。
[0008]目前，人们为了提高检测异质性耐药菌的效率和准确性，将E
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test法或纸片扩散法与PAP法相结合。通过将第一步E
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test法或纸片扩散法初筛的异质性耐药菌，经过第二步的PAP法进行确认。这样避免了单独的E
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test法或纸片扩散法的假阳性，也减轻了PAP法筛选的盲目性和工作量。然而该两步检测法进一步增加了实验的工作量和检测时间。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种简便的、准确性好的异质性耐药菌的检测方法。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术还提供了一种细异质性耐药菌的检测方法，包括如下步骤：
[0012](1)将菌液与EZMTT溶液混合，再分别加入系列浓度梯度的抗生素溶液中培养，得到菌在不同浓度抗生素溶液中的培养液；
[0013](2)测定所述培养液在450nm和630nm处的吸光度，绘制药敏生长率曲线；
[0014](3)若450nm处的药敏生长率曲线和630nm处的药敏生长率曲线中，若菌生长抑制率为80％时所对应的抗生素浓度相同，则判断为非异质性耐药菌；若不相同，而且630nm处的药敏生长率曲线中，最高非抑菌浓度与最低80％抑菌浓度之间相差8倍以上，则判断为异质性耐药菌。
[0015]优选的，所述菌优选为细菌和真菌。
[0016]优选的额，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌和非结核分枝杆菌。
[0017]优选的，所述菌液的浓度为1.5
×
105～1.5
×
108个/ml。
[0018]优选的，所述EZMTT溶液的体积浓度为0.1～1.0％。
[0019]本专利技术联合EZMTT法和传统浊度法，对样品在450nm(EZMTT法)和630nm(浊度法)同时进行吸光度的测定，并绘制细菌/真菌的药敏生长率曲线。根据两条曲线中菌生长抑制率为80％时，所对应的抗生素浓度是否相同、药敏生长率曲线的形状特征以及最高非抑菌浓度与最低完全抑菌浓度之间的倍数关系等信息，判断是否为异质性耐药菌。本专利技术的方法快速简单，检测的灵敏度和准确度相对于现有方法显著提高。
[0020]本专利技术检测方法的使用将能快速简便地检测临床致病菌中的异质性耐药菌。克服了E
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test法或纸片扩散法的特异性低、出现假阳性和PAP法操作繁琐、工作量大的缺点。此外由于该方法属于微量肉汤稀释法，还能减少其他异质性耐药检测方法所需的试剂(抗生素)和材料(纸片和琼脂平板)的用量。检测结果出来的时间也比PAP法的大大缩短。
附图说明
[0021]图1为纸片扩散法(A)和E
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test法(B)检测异质性耐药示意图；
[0022]图2为菌群谱分析法检测异质性耐药示意图；
[0023]图3为金黄色葡萄球菌在MNO抗生素处理下的药敏生长率曲线；
[0024]图4为金黄色葡萄球菌在NIT抗生素处理下的药敏生长率曲线；
[0025]图5为金黄色葡萄球菌在SXT抗生素处理下的药敏生长率曲线；
[0026]图6为金黄色葡萄球菌在CZO抗生素处理下的药敏生长率曲线；
[0027]图7为金黄色葡萄球菌在FEP抗生素处理下的药敏生长率曲线；
[0028]图8为金黄色葡萄球菌在SCF抗生素处理下的药敏生长率曲线；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异质性耐药菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将菌液与EZMTT溶液混合，再分别加入系列浓度梯度的抗生素溶液中培养，得到菌在不同浓度抗生素溶液中的培养液；(2)测定所述培养液在450nm和630nm处的吸光度，绘制药敏生长率曲线；(3)若450nm处的药敏生长率曲线和630nm处的药敏生长率曲线中，若菌生长抑制率为80％时所对应的抗生素浓度相同，则判断为非异质性耐药菌；若不相同，而且630nm处的药敏生长率曲线中，最高非抑菌浓度与最低80％抑菌浓度之间相差...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮奔放，
申请(专利权)人：杭州汉菁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：