检测食管癌的试剂及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及医学生物检测技术领域，提供了检测基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合，还提供了包含该组合的食管癌诊断试剂及试剂盒。经实验验证，本发明专利技术的方案区分早期食管腺癌、进展期食管腺癌、早期食管鳞癌、进展期食管鳞癌的灵敏度分别可达到59.38％、77.78％、80％和90％，其在健康人群中的特异性可达到94％。因此，本发明专利技术提供的引物对及探针组合、试剂或试剂盒在食管癌诊断中具有良好的灵敏度和特异性，更重要的是，其提高了早期食管癌的诊断率，且便捷、快速、无创，具有广阔的市场前景。景。

【技术实现步骤摘要】
NO.1和2所示，第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和11所示，第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0008]第一引物对和第一探针用于检测KCNA3基因的甲基化水平，第二引物对和第二探针用于检测OTOP2基因的甲基化水平。
[0009]优选的，探针的5'端含有荧光报告基团如FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、TexsaRed、JOE及Quasar 705中任意一种，3'端含有荧光淬灭基团，如MGB、BHQ
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1、BHQ
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2、BHQ
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3中的任意一种。
[0010]针对KCNA3基因，共设计了三种引物对及探针的核苷酸组合1～3，分别用来检测KCNA3基因的区域1(位置为Chr1:110674528
‑
110674658，正链)、区域2(位置为Chr1:110674719
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110674845，负链)及区域3(位置为Chr1:110674827
‑
110674964，正链)的甲基化水平。
[0011]针对OTOP2基因，共设计了两种引物对及探针的核苷酸组合4和5，分别用来检测OTOP2基因的区域4(位置为Chr17:74924472
‑
74924577，负链)和区域5(位置为Chr17:74924277
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74924416，负链)的甲基化水平。
[0012]此外，还设置核苷酸组合6，包括检测内参基因ACTB基因的上游引物，下游引物及荧光探针。核苷酸组合1～6中的引物序列、探针序列及相应检测区域的基因序列列举在表1中。
[0013]分别从核苷酸组合1～3中挑选任意一种，从核苷酸组合4～5中挑选任意一种，尝试所有的6种核苷酸组合方式用于同时检测KCNA3基因和OTOP2基因在待测样本上的甲基化水平，并分析比较不同的核苷酸组合的诊断性能。检出率最高的引物对及探针组合，即核苷酸组合1和核苷酸组合4的组合，来检测样本中KCNA3基因和OTOP2基因的甲基化水平，可以对早期食管癌包括食管癌腺癌进行有效诊断。
[0014]本专利技术的第二方面，提供了上述检测基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合在制备食管癌诊断试剂中的应用。
[0015]该食管癌诊断试剂用于检测生物样本中KCNA3基因的甲基化水平和OTOP2基因的甲基化水平，其中，所述第一引物对和所述第一探针用于检测KCNA3基因的甲基化水平，所述第二引物对和所述第二探针用于检测OTOP2基因的甲基化水平。
[0016]优选的，所述生物样本为食管组织样本、食管脱落细胞样本或血液样本；血液样本包括血浆、血清、全血、分离的血细胞或它们的组合。
[0017]优选的，通过所述食管癌诊断试剂采用如下方法中的至少一种检测生物样本中KCNA3基因的甲基化水平和OTOP2基因的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
[0018]本专利技术的第三方面，提供了一种食管癌诊断试剂，其至少包括检测KCNA3和OTOP2基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合，该PCR引物对及探针组合如上所述。
[0019]该食管癌诊断试剂还包括能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂。优选的，所述试剂为亚硫酸氢盐。
[0020]本专利技术的第四方面，提供了一种食管癌诊断试剂盒，包括检测KCNA3和OTOP2基因
甲基化水平的PCR引物对及探针组合，所述试剂盒还包括扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或者多种。
[0021]其中，该PCR引物对及探针组合如上所述。
[0022]优选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg
2+
中的一种或者多种。
[0023]阳性质控品为含有完全甲基化的KCNA3基因片段和OTOP2基因片段的质粒。
[0024]本专利技术提供的引物对和探针组合、检测试剂或试剂盒检测的是亚硫酸氢盐转化后的DNA序列，经亚硫酸氢盐转化后，DNA CpG二核苷酸中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。
[0025]本专利技术的第五方面，提供了食管癌相关基因甲基化水平的检测方法，包括如下步骤：
[0026]A、DNA提取
[0027]从组织、血液等样本中提取DNA；
[0028]B、DNA转化
[0029]将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化；
[0030]C、甲基化定量PCR反应
[0031]以亚硫酸氢盐转化后的待测样本DNA为模板，同时使用检测KCNA3基因甲基化水平的引物对及探针、检测OTOP2基因甲基化水平的引物对及探针(序列如第二方面所述)，并按照配方配置PCR反应体系，进行甲基化定量PCR反应。
[0032]D、甲基化结果判定
[0033]根据KCNA3基因、OTOP2基因的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本，若扩增某一基因的Ct值≤38，则认为该样本中此基因为甲基化阳性，若扩增某一基因的Ct值＞38，则认为该样本中此基因为甲基化阴性。对于血液样本，若扩增某一基因的Ct值≤48，则认为该样本中此基因为甲基化阳性，若扩增某一基因的Ct值＞48，则认为该样本中此基因为甲基化阴性。
[0034]E、食管癌诊断或辅助诊断结果判定
[0035]若待测样本中至少一个基因为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本；仅当待测样本中两个基因均为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
[0036]本专利技术的有益效果如下：
[0037]食管癌样本中，KCNA3基因和OTOP2基因的甲基化水平本质上是利用甲基化引物对通过qPCR扩增及探针杂交法来检测的，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点。使用本专利技术中的引物对及探针组合、试剂或试剂盒，利用荧光定量PCR的方法，可以对KCNA3基因和OTOP2基因的甲基化水平进行检测，从而根据Ct值来判断受试者是否患上食管癌。采用本专利技术所提供的特定的引物对和探针组合，区分早期食管腺癌、进展期食管腺癌、早期食管鳞癌、进展期食管鳞癌的灵敏度分别可达到59.38％、77.78％、80％和90％，其在健康人群中的特异性可达到94％。因此，本专利技术提供的引物对及探针组合、试剂或试剂盒具有良好的灵敏度和特异性，更重要的是，其提高了早期食管癌的诊断率，且便捷、快速、无创，具有广阔的市场前景。
[0038]就检测方式而言，只需要采集检测者的血液即可获得检测结果，操作简单、无创，
患者的接受程度以及依从性高。
具体实施方式
[0039]下面结合本专利技术的实施例对本专利技术的实施作详本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合，其特征在于，包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和11所示，所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。2.根据权利要求1所述的检测基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团。3.如权利要求1或2所述的检测基因甲基化水平的PCR引物对及探针组合在制备食管癌诊断试剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管癌诊断试剂用于检测生物样本中KCNA3基因的甲基化水平和OTOP2基因的甲基化水平，其中，所述第一引物对和所述第一探针用于检测KCNA3基因的甲基化水平，所述第二引物对和所述第二探针用于检测OTOP2基因的甲基化水平。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物样本为食管组织样本、食管脱落细胞样本或血液样本，所述血液样本包括血浆、血清、全血、分离的血细胞或它们的组合。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管癌诊断试剂采...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洛伟，周俊，张良禄，董兰兰，李兆申，边岩，高野，林寒，庞亚南，辛磊，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：