一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用，利用CRISPR/Cas9技术在删除TK基因的基础上删除A44L基因，通过荧光筛选获得纯的重组病毒。本发明专利技术病毒载体可以插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感染性疾病疫苗的基因。其中，病毒载体VVΔTKΔA44L

【技术实现步骤摘要】
一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用，属于分子生物学技术和肿瘤治疗领域。

技术介绍

[0002]痘苗病毒(VacciniaVirus,VV)是一种双链DNA病毒，曾被作预防天花感染的疫苗而在世界范围内被广泛应用，而其作为溶瘤病毒也有其独特的优越性。首先能快速在细胞内复制并裂解肿瘤细胞。其次痘苗病毒有广泛的噬肿瘤组织性，不需特定的表面受体识别而进入靶细胞，而是膜融合途径。第三，痘苗病毒具有大基因组，允许将多个外源基因片段插入基因组中，且可以选择性地在肿瘤细胞质内复制，不整合到宿主基因组，相较于其他病毒安全性更高。
[0003]自根除天花后，科学家使用痘苗病毒作为将目的基因运送到组织的载体用于治疗肿瘤为研究方向，也取得了一些研究成果。第一个进入临床阶段用于肿瘤治疗的重组痘苗病毒是JX
‑
594，是在删除了胸苷激酶(TK，J2R)基因区的基础上插入粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)。GMCSF，它通过诱导骨髓前体的增殖和分化以及树突状细胞的刺激、募集和成熟来促进抗肿瘤免疫。此外还有痘苗病毒GL
‑
ONC1是删除了TK、F4L、A56R的李斯特株，插入Luc
‑
GFP、β
‑
葡萄糖醛酸酶和β半乳糖苷酶三个基因，已用于治疗腹膜癌、头颈癌及卵巢癌等的临床研究。随着研究的不断深入和对宿主抗病毒机理的不断探究，构建一种稳定有效的包含外源基因插入区的重组痘苗病毒意义重大。
[0004]痘苗病毒李斯特株对癌细胞有着高度的固有选择性，且对体外测试的所有人类胰腺癌细胞有效，尤其是对溶瘤腺病毒不敏感的细胞，以李斯特株为载体进行改造构建重组病毒在肿瘤治疗中有较大应用价值。胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)为病毒DNA复制提供高水平的核苷酸池，正常细胞中TK浓度较低而在肿瘤细胞中高度表达，去除病毒TK基因使病毒更倾向于在DNA代谢旺盛、有高浓度TK和核苷酸池的肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞，这已在包括结肠癌、黑素瘤、肉瘤等在内的多种肿瘤细胞中得到证实。
[0005]痘苗病毒A44L基因区编码3
‑
β羟基类固醇脱氢酶，它参与类固醇激素代谢，催化孕烯醇酮转化为孕酮等反应。一些类固醇激素是糖皮质激素，被认为是有效的免疫抑制剂和抗炎剂，可调节细胞因子的产生以及免疫细胞的迁移和细胞毒性。因此，删除痘苗病毒李斯特株的TK和A44L基因可增强病毒的肿瘤选择性，提高病毒的安全性。目前尚缺乏TK和A44L删除的李斯特株溶瘤病毒。
[0006]SIRPα是属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜糖蛋白，在成纤维细胞、内皮细胞、骨髓细胞等表面均有表达。白细胞分化抗原47(CD47)是一种细胞膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在肿瘤细胞表面高表达。CD47结构域糖基化后，能与SIRPα、血小板反应蛋白
‑
1(TSP
‑
1)以及整合素结合。肿瘤细胞表面的CD47通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合，通过桩蛋白和切丝蛋白控制巨噬细胞的骨架使巨噬细胞失去机械力，能抑制巨噬细胞吞噬、DC的成熟和
吞噬、抗原加工与递呈从而产生免疫逃逸。痘苗病毒表达SIRPα
‑
Fc(IgG4)能有效阻断CD47
‑
SIRPα信号通路，增强肿瘤微环境中巨噬细胞识别吞噬肿瘤细胞的能力。
[0007]生长转化因子
‑
β(TGF
‑
β)是一种分泌多能因子，通过调节细胞增殖、分化和迁移，在胚胎发生和组织稳态中发挥重要作用。在许多癌症模型中，肿瘤细胞高表达的TGF
‑
β导致代谢紊乱和功能障碍，并促进上皮间质转化，上皮间质转化会导致化疗耐药性和肿瘤细胞逃避免疫监视。TGF
‑
β由细胞分泌并以无活性形式隔离在基质中，并且可以以整合素依赖性方式被激活。活化的TGF
‑
β配体与TGF
‑
βII型受体(TGFβRII)相互作用，后者在特定的丝氨酸和苏氨酸残基上募集并磷酸化TGF
‑
βI型受体。痘苗病毒表达TGFβRII
‑
Fc(IgG4)能干扰TGF
‑
β信号通路从而促进抗肿瘤免疫。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种同时删除TK和A44L基因的肿瘤靶向性痘苗病毒载体VVΔTKΔA44L
‑
RFP的构建方法，该载体能够构建携带有治疗基因的肿瘤靶向性痘苗病毒载体，该病毒载体具有靶向性、安全、抗肿瘤能力强的特点。
[0009]本专利技术还提供两种肿瘤靶向性痘苗病毒VVΔTKΔA44L
‑
SIRPα
‑
Fc和VVΔTKΔA44L
‑
TGFβRII
‑
Fc，利用人或鼠SIRPα
‑
Fc和TGFβRII
‑
Fc基因作为治疗基因，该病毒能选择地杀死肿瘤细胞，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0011]一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，所述重组溶瘤痘苗病毒载体为Lister株痘苗病毒，在已删除TK基因的基础上删除A44L基因，插入任意用于治疗肿瘤的基因或感染性疾病疫苗的基因。
[0012]所述的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，所述治疗肿瘤的基因为SIRPα
‑
Fc或TGFβRII
‑
Fc。
[0013]所述重组溶瘤痘苗病毒载体为VVΔTKΔA44L
‑
RFP，构建方法包括以下步骤：
[0014](1)用基因合成方法将A44L基因上游序列SEQ ID NO:1、报告基因红色荧光蛋白SEQ ID NO:3和A44L基因下游序列SEQ ID NO:2依次连接到质粒载体pUC57上，构建穿梭载体pUC
‑
A44L质粒；
[0015](2)根据A44L基因序列设计gRNA序列SEQ ID NO:4，将gRNA连接到PB
‑
gRNA载体上构建PB
‑
gRNA
‑
A44L；
[0016](3)将CV1细胞接种到六孔板，细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB
‑
gRNA
‑
A44L混合质粒，经过24小时后感染删除TK基因的VVΔTK，再经2小时后转染所述的pUC
‑
A44L质粒；再经过48小时，收集上清和细胞的混合物，冻融3次，按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中；48小时后，在荧光显微镜下挑取红色荧光的单克隆细胞；将单克隆溶液冻融后按5微升/孔加入铺满CV1细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种删除A44L基因的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒载体为Lister株痘苗病毒，在已删除TK基因的基础上删除A44L基因，插入任意用于治疗肿瘤的基因或感染性疾病疫苗的基因。2.如权利要求1所述的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述治疗肿瘤的基因为SIRPα
‑
Fc或TGFβRII
‑
Fc。3.如权利要求1或2所述的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒载体为VVΔTKΔA44L
‑
RFP，构建方法包括以下步骤：(1)用基因合成方法将A44L基因上游序列SEQ ID NO:1、报告基因红色荧光蛋白SEQ ID NO:3和A44L基因下游序列SEQ ID NO:2依次连接到质粒载体pUC57上，构建穿梭载体pUC
‑
A44L质粒；(2)根据A44L基因序列设计gRNA序列SEQ ID NO:4，将gRNA连接到PB
‑
gRNA载体上构建PB
‑
gRNA
‑
A44L；(3)将CV1细胞接种到六孔板，细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB
‑
gRNA
‑
A44L混合质粒，经过24小时后感染删除TK基因的VVΔTK，再经2小时后转染所述的pUC
‑
A44L质粒；再经过48小时，收集上清和细胞的混合物，冻融3次，按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中；48小时后，在荧光显微镜下挑取红色荧光的单克隆细胞；将单克隆溶液冻融后按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中，48小时后再次挑取单克隆细胞，直至荧光显微镜下全部为红色荧光，即为重组溶瘤痘苗病毒载体VVΔTKΔA44L
‑
RFP。4.如权利要求2所述的重组溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述重组溶瘤痘苗病毒载体为VVΔTKΔA44L
‑
SIRPα
‑
Fc，构建方法包括以下步骤：(1)用基因合成方法把A44L基因上游序列、报告基因红色荧光蛋白和A44L基因下游序列按顺序连接到质粒载体pUC57上，构建穿梭载体pUC
‑
A44L质粒；(2)根据A44L基因序列设计序列gRNA：SEQ ID NO:4，将gRNA连接到PB
‑
gRNA载体上构建PB
‑
gRNA
‑
A44L；(3)将人的SIRPα序列SEQ ID NO:5、鼠的SIRPα序列SEQ ID NO:6、Fc序列SEQ ID NO:7合成得到SIRPα
‑
Fc序列，将SIRPα
‑
Fc序列连接到pUC57载体上，得到pUC
‑
SIRPα
‑
Fc；用Sal I和Nhe I双酶切所述的pUC
‑
SIRPα
‑
Fc、pUC
‑
A44L质粒，分别纯化酶切后的SIRPα
‑
Fc和pUC
‑
A44L片段，然后用T4 DNA聚合酶将切出的SIRPα
‑
Fc基因片段和pUC
‑
A44L连接，构建pUC
‑
A44L
‑
SIRPα
‑
Fc；(4)将CV1细胞接种到六孔板，细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB
‑
gR...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏举，韩冰，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：