【技术实现步骤摘要】
GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法
[0001]本专利技术属于生物技术
，具体的说是GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法。
技术介绍
[0002]肠缺血再灌注(Intestinalischemia/reperfusion，II/R)损伤是一种常见的威胁生命的并发症，死亡率很高在60
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80％之间，由一系列病理情况如急性肠系膜缺血、严重烧伤或感染、休克和腹主动脉手术等引起。除了肠道损伤外，缺血再灌注也会导致远端器官损伤和衰竭。大量的证据表明，肺是II/R损伤中最脆弱的远端器官，此外，急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)已被证明是II/R损伤期间死亡的主要原因。尽管进行了广泛的研究，但II/R损伤诱发ALI的机制还没有完全阐明。
[0003]众所周知，中性粒细胞是先天免疫中的关键角色，为了抑制病原体，中性粒细胞产生胞外诱捕网，称为中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophilextracellulartraps，NETs)，由附有组蛋白的染色质细丝和颗粒状的酶组成。越来越多的证据表明，NETs是一把双刃剑，因为在许多炎症性疾病(包括ALI)中，NETs的过度释放会引发凝血、炎症和细胞死亡，从而有助于疾病的发展，高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)是II/R期间从受伤的肠细胞释放的主要损伤相关分子模式(Damage
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associatedmolecularpatterns，DAMP...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法，其特征在于，该研究方法如下所示：S1：实验动物分组及其肠缺血再灌注损伤模型的建立；S2：样本采集；S3：切片制备及其HE染色；S4：肺泡灌洗液的检测；S5：蛋白质印记分析(WesternBlot)；S6：统计学分析。2.根据权利要求1所述的GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法，其特征在于，所述S1具体方法如下所示A1：选择C57BL/6J雄鼠，8
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12周，22
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3g，共32只，按照随机分配的原则，将32只健康雄鼠以每组8只分为四组，分别命名为：Sham+PBS组，Sham+DHBA组，II/R+PBS组，II/R+DHBA组；A2：在实验前24小时，各组小鼠被禁食，可以自由饮水，将四组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉，随后将其固定在恒温毯上，各组小鼠在实验结束之前均保持麻醉状态，将II/R+PBS组和II/R+DHBA组小鼠的腹部手术区域用碘伏消毒，在腹中线位置用眼科剪切口开腹，经正中切口在腹部找到并轻柔地分离肠系膜上动脉(superiormesentericartery，SMA)，SMA根部被无创微型动脉夹夹闭45分钟，缺血成功时可以观察到SMA停止脉搏和小肠颜色迅速变苍白，随后将小肠轻柔地放入腹腔内，采用4
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0丝线对切口进行缝合，在缺血45min后拆除缝线，轻柔地取出微型动脉夹开始再灌注，成功灌注后可以观察到小肠重新出现粉红色和肠道蠕动，进行90分钟的再灌注，再灌注开始前的10分钟向II/R+DHBA组小鼠注射DHBA(60mg/kg)和向II/R+PBS组小鼠注射PBS缓冲液；A3：将Sham组的小鼠实施了同样的手术操作除了夹闭SMA，小鼠在45分钟的肠道缺血和90分钟的再灌注后被处死，再灌注开始前的10分钟向Sham+DHBA组小鼠注射DHBA(60mg/kg)和向Sham+PBS组小鼠注射PBS缓冲液，在获得的血液、BAFL样本和肺组织分别进行相应的分析，其中DHBA是指3，5
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二羟基苯甲酸，II/R是指肠缺血再灌注损伤(Intestinalischemia/reperfusion)。3.根据权利要求2所述的GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法，其特征在于，所述S2具体方法如下所示：B1：血清、肠组织、肺组织样本采集：剪去麻醉的小鼠胡须后使用用弯头镊进行眼球取血，收集到的血液保存于1.5mlEP管内，静置30min后在4℃、8000rpm的条件下进行15min离心，然后用0.5ml的EP管收集血清，存放于
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80℃低温冰箱备用；处死小鼠后首先打开胸腔，暴露胸腔并取出双侧的肺脏，表面血液用4℃预冷却的生理盐水(0.9％NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)轻轻冲洗，取小鼠右上肺组织，用4％多聚甲醛固定，将剩下肺组织置于
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80℃冷藏，以作进一步的检查；剖开小鼠的腹部，切下离回盲瓣数5cm的小肠组织，将其中的一份置于4％的多聚甲醛中，在室温下进行保存，另外一份则置于
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80度冷藏，以备进一步的研究；B2：肺泡灌洗液样本采集：将小白鼠置于解剖架上，在小白鼠的颈部剪开1cm左右的切口，使其皮下组织完全暴露，用钳夹取小鼠的甲状腺，切除小鼠的气管前部肌肉，使气管和气管下的组织完全暴露，
然后在气管下通过缝合线，用10ml的注射器粗针尖刺穿大鼠的甲状软骨与环形软骨之间的空隙，将气管软管在插入气管内约1cm深，用穿好的缝合线绕气管结扎固定气管软管套针；提前准备好1ml的注射器，抽取0.8ml的生理盐水，相接到气管软管套针，将生理盐水注入肺内，然后慢慢抽回，每次吸入0.8毫升的生理盐水，3次后，将其吸入EP管内；对每个小鼠进行三次灌洗，总共灌洗2.4ml的生理盐水，将3次的灌洗液收集到于同一个EP管中，将灌洗液在4℃、8000rpm的条件下离心10min后取上清液，置于
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80℃保存。4.根据权利要求3所述的GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法，其特征在于，所述S3具体方法如下所示：C1：组织切片制备：固定：将新鲜的肠道组织放入4％的多聚甲醛溶液，固定24小时，目的为了保持组织和细胞的形态，防止其发生变化，并能使蛋白质发生变性，易于染色；冲水：取出相应的包埋盒，用铅笔做标记，24小时后，将组织分别放入有编号的盒子中，用清水冲洗2小时；脱水：将包埋盒按照浓度梯度从低到高分别置于不同浓度的乙醇罐中进行脱水，脱水时间为1小时；透明：准备好两罐二甲苯，相应命名为1号二甲苯和2号二甲苯，脱水后，用1号二甲苯和2号二甲苯分别浸泡20分钟和30分钟直到组织呈透明的琥珀色；浸蜡：将透明的组织从包埋盒中取出，依次置于盛有石蜡液的玻璃容器内，在55℃下浸泡30分钟；包埋：用金属模具把组织块包入石蜡，组织位于金属框架底部的中央，放在制冷台上数秒，使底部可以观察到薄霜，并将其置于制冷平台上冷凝，直到可以轻轻的取下组织，将两边的余蜡去掉，即可开始切片；切片、展片：用刀片对蜡块进行处理，首先是粗切割，然后在组织充分暴露后再进行精细切割，切片的厚度是5微米，先切成连续平整的切片，最后分割蜡带，分开的蜡片漂浮在43℃温水上，把蜡片展平，待蜡片光滑后，即可捞取，用洁净的载玻片基本垂直于水面与蜡片接触，然后将蜡片平铺于载玻片上，并将其置于载玻片中心；烤片：将烘干机的温度设定为40～45度，前一步骤得到的载玻片放入烘干机大约12h进行烘干；C2：HE染色：脱蜡及复水：在烤片后，按顺序把切片放在二甲苯中去蜡，1号二甲苯和2号二甲苯的脱蜡时间分别为20min，在脱蜡之后，将切片按照从高浓度到低浓度依次放入乙醇中(100％，90％，85％，75％，50％)，每缸复水5min，最后放入纯水中静置5min；苏木精染色：将复水后的切片用苏木精液染7min，取出后用清水冲洗3分钟，显微镜下观察染色的效果，待染色程度合适后，用1％的盐酸乙醇浸泡5s，用纯水冲洗，显微镜下观察，以测定染色状态；伊红染色：将上一步得到的切片置于伊红染液中浸透50s，用90％的酒精溶液冲洗后用显微镜观察染色效果；复水及透明：染色完后的切片放入100％乙醇溶液中进行5min脱水，在依次分别置于乙醇二甲苯(比例1:1)溶液缸，1号二甲苯缸和2号二甲苯缸中各透明6min；封片：从二甲苯中拿出带标本的载玻片，轻放于纸上，用牙签沾1
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2滴中性树胶，快速滴入染色后的玻片上，显微镜镜下观察HE染色并拍照。5.根据权利要求4所述的GPR81在肠缺血再灌注损伤诱导的急性肺损伤中的研究方法，其特征在于，所述S4具体方法如下所示：D1：BCA法检测蛋白浓度采用BCA蛋白定量微孔检测法测定S3中肺泡灌洗液上清液中的蛋白浓度，具体步骤如下：将BSA标准品(2μg/μl)用0.9％生理盐水稀释，按顺序稀释成2，1，0.5，0.25，0.125，
0.0625，0μg/μl；将稀释好的标准品与待测样品(样品浓度稀释40倍)各25μl，分别加入到96孔板微孔中，并对其进行标记；在每个孔中加入200μl的AB液(A液：B液＝50:1)，在37℃下孵育30分钟，等将其冷却到室温后，再用酶标法检测562nm的OD值；以标准品浓度梯度及相应的OD值为依据，以OD值为横轴，标准品浓度为纵轴，绘制一条标准曲线，在得到标准曲线公式之后，将样本OD值进行代换，得到的数值乘以40，就是肺泡灌洗液上清液样本浓度；D2：BALF总细胞计数从
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80℃的冷藏室中取出S3中肺泡灌洗液，放置室温下融化，轻柔地混匀，1500rpm离心10min，沉淀物用500μlPBS重悬；将10μL样本混合物加入到细胞计数板一侧的计数池口中，计数板的两个计数池分别标记为“A”和“B”，以便于追踪样本；插入细胞计数板，先把A侧样本插入到细胞计数板接口，保证A侧样本插入到仪器中；按下计数细胞(CountCells)按钮并记录好结果；D3：ELSA法检测IL
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6从
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80℃的冷藏室中取出S3中肺泡灌洗液，放置室温下融化，轻柔地混匀，将肺泡灌洗液用IL
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6ELISA试剂盒内的通用稀释液稀释2倍用于测定IL
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6水平；在实验20分钟之前，从4℃冰箱取出ELISA试剂盒，常温下复温，根据说明书的要求提前准备好1
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洗涤液；将标准品从试剂盒中取出，在4℃、1000rpm的条件下离心1min，然后加入通用稀释液1ml充分混匀，轻轻震荡混匀，该浓度为1000pg/ml，将标准品按比例依次稀释成为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml，用0pg/ml(空白孔)、15.6pg/ml、31.25pg/ml、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml分别7个不同浓度制作一条标准曲线；在抗体包被板上提前设定好了标准孔、空白孔、待测样品孔，将各不同浓度标准品依次加入到标准孔(每孔100ul)，用把0pg/ml(标准稀释液)孔设为空白孔，每个待测样品孔依次加入对应的样本(肺泡灌洗液)100μl，在加样完后，盖上塑料封板膜，37℃恒温条件下孵育90分钟，孵育完毕后将板条洗5次，每次洗完后在滤纸上将水轻轻拍干；预先20min将生物素化抗体原液稀释成工作液，将100μl的稀释好的工作溶液加入样本孔，空白孔只需加入同等体积的生物素化抗体稀释液，盖上塑料封板膜，在37℃水浴箱恒温孵育60min，孵育完毕后将板条洗5次，每次洗完后在滤纸上将水轻轻拍干；预先20min将浓缩酶结合物原液稀释成酶结合工作液，注意避光保存，在每个样本孔加入配好工作液100μl，而空白孔只需加入同等体积的稀释液，盖上塑料封板膜，在37℃水浴箱恒温避光孵育30min，孵育完毕后将板条洗5次，每次洗完后在滤纸上将水轻轻拍干；依次将显色剂TMB溶液100μl加入到各个孔中，盖上塑料封板膜，于室温避光孵育15min，孵育完毕后在每个孔中加入反应终止液100μl，轻轻混匀后立即测量A450时的OD值，将每个样本孔测量值减去对应的空白孔测量值的绝对值带入到标准曲线，乘以之前稀释的倍数，这样就可以得出肺泡灌洗液中IL
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6的浓度；D4：dsDNA定量检测采用quantu...
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