一种分泌CTLA-4纳米抗体靶向FAP新型CART细胞制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种分泌CTLA

【技术实现步骤摘要】
一种分泌CTLA
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4纳米抗体靶向FAP新型CAR T细胞制备方法和应用


[0001]本专利技术属于肿瘤生物制品领域，涉及过继免疫治疗中的一种分泌CTLA
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4纳米抗体靶向FAP的CAR T细胞(FAP
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CTLA
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4/Nb CAR T细胞)制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]T细胞可以通过表达CAR靶向肿瘤细胞。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)通过将可以特异性识别肿瘤抗原的单链抗体与可活化T细胞的受体胞内结构域“免疫受体酪氨酸活化基序”用人工方法融合成重组基因来制备。CAR
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T细胞疗法是目前肿瘤免疫治疗的当下最热门最有研究价值的治疗方法。目前CAR T治疗在血液肿瘤中取得了很好的进展，但是由于实体肿瘤微环境复杂，CAR T对实体瘤的杀伤效果有限，因此需要探索新的方法来提高CAR T治疗实体肿瘤的活性。
[0003]CAR的基础设计中包括肿瘤相关抗原结合区、胞内信号区、跨膜区、胞外铰链区等。CAR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌CTLA
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4纳米抗体靶向FAP的CAR T细胞，其特征在于所述CAR T细胞表达嵌合抗原受体FAP VHH
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HIStag
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CD8
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CD137
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CD3ζ
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CTLA
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4VHH
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GFP，所述嵌合抗原受体由胞外抗原识别区FAP VHH、标签蛋白HIS
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tag、铰链区CD8、跨膜区CD8、胞内共刺激域CD137、胞内信号转导域CD3ζ、CTLA
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4VHH以及GFP荧光蛋白串联构成。2.如权利要求1所述的分泌CTLA
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4纳米抗体靶向FAP的CAR T细胞，其特征在于所述胞外抗原识别区FAP VHH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CTLA
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4VHH的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述标签蛋白HIS
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tag如SEQ ID NO.4所示。3.如权利要求1所述的分泌CTLA
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4纳米抗体靶向FAP的CAR T细胞，其特征在于所述嵌合抗原受体FAP VHH
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HIStag
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CD8
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CD137
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CD3ζ
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CTLA
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4VHH
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GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种如权利要求1所述的CAR T细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：设计CAR目的序列，通过PCR法获得FAP/Nb
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HIStag
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CD8
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CD137(4
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1BB)
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CD3ζ
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2A
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CTLA
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4Nb
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IRES
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GFP的CAR目的序列片段，将酶切后的慢病毒载体GV400与PCR法得到的CAR目的序列重组，将重组后的慢病毒载体转化至DH5α大肠杆菌中，并且筛选阳性克隆菌，对阳性克隆菌测序验证是否成功构建含有FAP
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CTLA
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4/Nb CAR序列的慢病毒载体，将测序成功的重组阳性克隆菌株提取质粒，转染293T细胞后通过RT
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PCR鉴定FAP
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CTLA
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4/Nb CAR序列在细胞中的表达情况，验证重组慢病毒载体能正常表达后使用三质粒系统包装慢病毒，滴度检测，利用慢病毒感染技术构建CAR T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。5.一种如权利要求4所述的CAR T细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)含有目的CAR序列的重组慢病毒载体构建：PCR法获得FAP/Nb
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HIStag
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CD8
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CD137(4
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1BB...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，李杨子，杨晓梅，王旋，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：