胰腺癌诊断或筛查生物标志物及其用途制造技术

本发明专利技术公开了胰腺癌诊断或筛查生物标志物及其用途。本发明专利技术通过检测ctDNA

【技术实现步骤摘要】
胰腺癌诊断或筛查生物标志物及其用途


[0001]本专利技术涉及肿瘤标志物，涉及胰腺癌诊断或筛查生物标志物及其应用，属于胰腺癌诊断或筛查生物标志物领域。

技术介绍

[0002]胰腺癌(PDAC)作为“癌中之王”，恶性程度极高，其发病率为3％，五年生存率仅为10％，死亡率高达8％(死亡率居于恶性肿瘤死亡率第4位，仅次于结直肠癌)。而近年来，由于人类生活环境、饮食习惯等的改变，比如吸烟、高热量食物、运动量下降等，胰腺癌发病率呈上升趋势。
[0003]吉西他滨作为胰腺癌一线临床用药，对胰腺癌缓解率低于12％，因此，目前联合用药成为胰腺癌化疗的主要手段。但是，化疗耐药也成为当前胰腺癌治疗过程中的棘手问题。胰腺癌恶性程度如此之高，主要是因为起病隐匿、早期诊断困难，而且胰腺癌具有高度转移性，大于50％的病人在诊断时或者诊断后会出现远处转移，失去根治的机会，并且预后极差。故胰腺癌的复发和转移是影响患者预后和困扰临床的难题。因此，准确的诊断手段、精准的治疗方案、高灵敏度的预后诊断指标成为当前改善胰腺癌预后的主要措施。而胰腺癌高危人群必须保持警惕，采取必要的措施预防发生胰腺癌，并定期筛查。尤其一旦出现胰腺癌的一些相关症状，必须及时检查，以便能阻止胰腺癌的发生，一旦发病也可早期诊断、早期治疗，以期获得好的治疗效果。
[0004]目前，腹部B超、CT/增强CT、磁共振MRI、PET
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CT是胰腺癌最常用的诊断方法。但是，技师的操作方式，患者身体状态如肥胖、肠道气体以及其他因素，诊断医生的经验和阅历都会影响诊断的准确性。此外，与其他消化道肿瘤相比，由于胰腺的特殊位置，要进行早期诊断并不容易。因此，鉴定敏感和特异的非侵入性生物标志物对于胰腺癌的早期诊断将非常有价值。
[0005]进入21世纪以来，随着分子生物学技术的发展，肿瘤生物标志物的发展不断得到优化和完善。在已经纳入常规肿瘤检查的血清肿瘤生物标志物中，包括糖类抗原CA199、CA125和癌胚抗原CEA，为胰腺癌的辅助诊断指标，同时有部分回顾性研究指出也是胰腺癌不良预后的预测危险因素。现有技术虽有报道通过检测血清中肿瘤生物标志物(CA199、CA125、CEA)变化结合临床症状、影像学诊断、病理学检查对胰腺癌做出诊断，但是所谓肿瘤生物标志物水平变化并不能直接代表肿瘤组织分子生物学的改变，而且所谓肿瘤生物标志物对胰腺癌的早期诊断以及治疗预后评价的特异性低，尚需要大数据支持，需要耗费大量的人力财力支持。
[0006]近年来，肿瘤来源的循环DNA(ctDNA)(称为癌症患者血液中肿瘤源性遗传物质)由于其临床优势而引起了医学界的更多关注。作为小双链DNA片段，ctDNA由肿瘤细胞释放并在外周血中循环。在肿瘤发生期间，细胞坏死和细胞凋亡的增加导致ctDNA的积累，可以在肿瘤相对较早的阶段检测到。此外，ctDNA不仅包含与肿瘤细胞相同的突变，而且具有相同的甲基化模式，从而为早期癌症诊断，甚至对于那些隐藏的器官(如胰腺和胆管)的诊断提
供了可能和便利。
[0007]而甲基化DNA免疫沉淀结合高通量测序(MeDIP
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seq)是检测DNA甲基化的灵敏技术，甚至可以检测低至1ng的初始DNA量。因此，最近已经开发出使用MeDIP
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seq方法对ctDNA甲基化谱进行全基因组检测，以筛查早期癌症的潜在生物标记。
[0008]此外，作为细胞间紧密连接结构的关键蛋白，Claudins(CLDNs)家族广泛分布于各种上皮组织，包含至少27个家族成员，结构包括4个跨膜区和2个胞外环，均是定位于细胞膜表面的跨膜蛋白，具有高度一致性，且这种一致性在跨膜区尤为显著。研究发现，CLDNs蛋白与上皮细胞维持渗透压、屏障功能以及细胞极性密切相关，且参与对病原体的免疫防御过程。另外，CLDNs被证实在许多肿瘤的发生发展过程中存在表达模式的改变，将CLDNs谱系作为特异性标志蛋白的靶向治疗研究已得到广泛关注。

技术实现思路

[0009]本专利技术的主要目的是提供胰腺癌诊断或预后指生物标志物；
[0010]本专利技术的另一目的是将所述的生物标志物应用于制备诊断或筛查胰腺癌的产品。
[0011]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案包括：
[0012]本专利技术提供了通过检测ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平的试剂在制备诊断或筛查胰腺癌的产品中的应用，其中，所述的ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平是在胰腺癌的组织或样品中表达水平下调。
[0013]所述的产品包括试剂盒、芯片、检测试纸条或药物组合物等。
[0014]所述试剂包括通过PCR检测试剂，免疫检测试剂，原位杂交或芯片检测ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平的试剂；
[0015]所述的PCR检测可以是荧光定量PCR或者是RT
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PCR，所述的PCR检测的所扩增的片段的序列中包含SEQ ID NO.1所示序列的CpG岛核酸序列。
[0016]当采用荧光定量PCR进行扩增时，所述的扩增引物包括一对正向和反向引物以及与ctDNA
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CLDN18.2特异性结合的荧光素探针。
[0017]本专利技术的检测试剂盒用于胰腺癌诊断或筛查的原理如下：
[0018]本申请人的研究发现：1)CLDN18.2在胰腺癌早期就发生显著异常的去甲基化，由于肿瘤组织CLDN18.2表达水平显著上升，所以检测血浆中CLDN18.2的异常甲基化水平可用于早期胰腺癌的筛查以及评估；2)CLDN18.2的异常高表达与胰腺癌患者的无复发生存期、肿瘤分化程度等预后指标密切相关，CLDN18.2高表达者预后不良可为胰腺癌病人评估临床治疗进展以及判断预后趋势。
[0019]基于上述本申请人的研究结果，本专利技术提取外周血中的游离DNA，然后用亚硫酸盐转化未发生甲基化的胞嘧啶，通过脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐，发生甲基化的胞嘧啶则不会被亚硫酸盐转化。将重亚硫酸盐转化的DNA(BisDNA)做多重PCR扩增，PCR反应中的引物、探针能区分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列优先得到扩增。与甲基化CLDN18.2基因序列特异性结合的荧光素探针可以在PCR反应中专一地检测出甲基化序列。内参对照ACTB(β
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actin)基因可用于评估检测中DNA量是否足够。
[0020]在一种优选的实施方案中，本专利技术提供ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平检测试剂盒用于制备胰腺癌诊断或筛查试剂盒的用途，其中所述的引物有3对，第一对的正向引物的序列
如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示；第二对的正向引物的序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示；第三对的正向引物的序列如SEQ IDNO.6所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.7所示。
[0021]在一种优选的实施方案中，本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平的试剂在制备诊断或筛查胰腺癌的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平是在胰腺癌的组织或样品中表达水平下调。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平的试剂包括通过PCR检测，免疫检测，原位杂交或芯片检测ctDNA
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CLDN18.2甲基化水平的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝继辉，刘静，解永杰，周天兴，王轶菲，白伟伟，李雪洋，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院天津医科大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：