一种生物纳米微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种生物纳米微球及其制备方法和应用，本发明专利技术的生物纳米微球表面基团丰富、微球磁核稳定、粒径小而均一、核酸吸附效率高、微球磁性强、对PCR反应无抑制，且可以实现大规模量产。利用该生物纳米微球进行核酸提取可以获得高纯度和丰度的待测核酸，在洗脱前还可以直接用于PCR扩增。可以直接用于PCR扩增。可以直接用于PCR扩增。

【技术实现步骤摘要】
一种生物纳米微球及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物纳米微球
，尤其涉及一种生物纳米微球及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]核酸提取是在各种样品中通过一系列裂解、洗涤、洗脱等过程提取到待测核酸的过程。核酸提取是分子实验中最基础的实验，后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等都建立在核酸提取的实验基础之上。核酸提取的浓度和纯度决定了后续实验的准确性。实践中核酸提取方式主要分为三类：溶液型提取、吸附柱式提取和微球法提取。溶液型提取是比较经典的提取方法，一般是使用去污剂(如SDS)和盐(如盐酸胍、Tris、NaCl等)进行提取，盐的作用除了提供一个合适的裂解环境外，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸结构的稳定。吸附柱式提取是使用裂解液、抽提液、沉淀剂、去蛋白液、漂洗液、洗脱液和核酸吸附柱等，利用核酸与吸附柱的吸附作用，经过一系列操作获得高纯度的核酸。微球法提取是一种采用生物纳米微球和缓冲液系统，样品在磁力架或者自动核酸提取仪上进行核酸提取，该方法的核心材料为一种可以结合核酸的生物纳米微球。
[0003]生物纳米微球是一种可以和核酸结合的生物材料，有的微球甚至可以和药物、蛋白质、酶和抗体等结合。最开始的微球被广泛应用于多种体内实验的药物传递、成像造影等实验。但是因为微球材料本身的生物相容性和细胞毒性等等因素，限制了微球在体内实验的应用，反而体外实验应用得到更广泛的发展。早在上个世纪六十年代初就有科学家尝试使用生物微球来分离细胞，利用的是细胞表面抗原和特异性抗体的结合性质原理，使用生物微球分离细胞。上世纪七十年代年科学家Guesdon和Avramea开始研究磁性的生物微球和抗原/抗体的连接反应，并在1977年成功开发磁性固相酶免疫分析技术，为将来使用微球来分离细胞以及更广阔的分子生物学研究应用打下基础。彼时所用微球结构为4％的聚丙烯酰胺、4％的琼脂糖和7％包裹在微球里面的氧化铁，微球表面有醋酸基团，粒径范围为50μm～160μm，属于羧基微球。这种生物微球磁性较弱，分离速度教慢，效率较低，且成本高昂。经过不断摸索，逐渐对微球表面的标记进行优化，产生了可以跟核酸高效率结合的生物纳米微球，该类微球表面修饰有特殊化学基团，在一定条件下对DNA/RNA具有很强的富集能力，当条件改变时有可以可逆的释放DNA/RNA，从而达到快速分离纯化DNA/RNA的目的，并可去除蛋白质等杂质。提取所得的高质量核酸可用于PCR、RT
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PCR、基因测序等系列实验。
[0004]现有技术的缺点在于，生物微球的制作方法工艺繁琐，量产困难，制备的微球磁性较弱，核酸结合效率低，制作且成本高昂，更为重要的是现有微球对于一些微量和珍贵样品不能实现对微球与核酸结合物的直接扩增检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术第一个方面提出一种生物纳米微球，该生物纳米微球表面基团丰富、微球磁核稳定、粒径小而均
一、核酸吸附效率高、微球磁性强、对PCR反应无抑制，且可以实现大规模量产。利用该生物纳米微球进行核酸提取可以获得高纯度和丰度的待测核酸，在洗脱前还可以直接用于PCR扩增。
[0006]本专利技术的第二个方面提出了一种所述生物纳米微球的制备方法。
[0007]本专利技术的第三个方面提出了一种包括所述生物纳米微球的核酸提取试剂盒。
[0008]本专利技术的第四个方面提出了一种采用所述生物纳米微球进行核酸提取的方法。
[0009]根据本专利技术的第一个方面，提出了一种生物纳米微球制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1：惰性氛围下，二价铁盐、三价铁盐与其他二价可溶性盐溶于水，加入有机溶剂后再加入辅助试剂，溶剂热反应后加入碱性添加剂，搅拌，收集沉淀得纳米磁性微球；
[0011]S2：向所述纳米磁性微球加入有机溶剂，调节pH至碱性，惰性氛围下加热后加入包被试剂和氨水，搅拌，收集沉淀得所述生物纳米微球。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述二价铁盐、所述三价铁盐与所述其他二价可溶性盐的质量比为(5～10)：(10～15)：(3～10)。
[0013]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述二价铁盐包括FeCl2、FeSO4或Fe(NO3)2的至少一种。
[0014]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述三价铁盐包括Fe2Cl3、Fe2(SO4)3或Fe(NO3)3的至少一种。
[0015]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述其他二价可溶性盐包括ZnCl2、MgCl2或CuCl2的至少一种。
[0016]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述有机溶剂选自异丙醇或甘油和乙醇。
[0017]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，S1中，所述有机溶剂与所述水的体积比为(4～8)：3。
[0018]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述辅助试剂的质量浓度为5.0g/L～8.0g/L。在该质量浓度范围内，能够很好调节微球成核。浓度过大会导致结晶过度微球磁核悬浮和不稳定；浓度过小会导致结晶不足微球磁核呈弥散状和磁性不足。
[0019]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述辅助试剂包括KCl、NaCl、SDS(十二烷基磺酸钠)或CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)中的至少一种；优选的，所述辅助试剂包括KCl、NaCl和CTAB；进一步优选的，所述辅助试剂包括KCl、NaCl和CTAB按照质量比为(4～6):(3～5)：(5～7)混合而成。辅助试剂在微球磁核行程的过程中起到桥联作用，一定比例的上述试剂的混合溶液可以控制微球磁核的粒径、密度、磁性和沉降性起到重要作用，优化的比例浓度可以筛选出不同粒径和磁性的微球磁核，可以适用于不同的应用场景。
[0020]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述溶剂热反应的温度为25℃～45℃，时间为10h～16h。
[0021]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述碱性添加剂为NaOH和氨水；优选的，所述碱性添加剂的添加顺序为先添加NaOH再添加氨水；更优选的，所述NaOH和所述氨水的体积比为(3～7)：(2～4)；进一步优选的，所述NaOH的浓度为52％，氨水的质量分数为25％，所述NaOH溶液的添使用量为100～300ml/1000mLS1的混合物，所述氨水的添使用量为150～200ml/1000mLS1的混合物。
[0022]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，S1中所述搅拌的转速为800rpm～1200rpm，
时间为12h～20h。
[0023]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，S1还包括对所述纳米磁性微球进行纯化的步骤，所述纯化包括采用水和所述有机溶剂洗涤3～5次，充分去除可溶性盐离子。
[0024]在本专利技术的一些更优选的实施方式中，S2中，加入NaOH和氨水调节pH至碱性；优选的，S2中，加入NaOH和氨水调节pH至10.0～11.0；进一步优选的，S2中，先加入NaOH再加入氨水调节pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物纳米微球制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：惰性氛围下，二价铁盐、三价铁盐与其他二价可溶性盐溶于水，加入有机溶剂后再加入辅助试剂，溶剂热反应后加入碱性添加剂，搅拌，收集沉淀得纳米磁性微球；S2：向所述纳米磁性微球加入有机溶剂，调节pH至碱性，惰性氛围下加热后加入包被试剂和氨水，搅拌，收集沉淀得所述生物纳米微球。2.根据权利要求1所述的生物纳米微球制备方法，其特征在于：所述二价铁盐、所述三价铁盐与所述其他二价可溶性盐的质量比为(5～10)：(10～15)：(3～10)。3.根据权利要求1所述的生物纳米微球制备方法，其特征在于：所述辅助试剂的质量浓度为5.0g/L～8.0g/L。4.根据权利要求3所述的生物纳米微球制备方法，其特征在于：所述辅助试剂包括KCl、NaCl、SDS或CTAB中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐贵峰，蒋军，徐德峰，
申请(专利权)人：广州蔚捷生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：