一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法技术

本发明专利技术公开了一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，包括以下步骤：（1）发酵液过滤后得到过滤液；（2）调节过滤液的pH，过滤得到除钙液；（3）除钙液经过交换树脂吸附、洗杂、洗脱，得到洗脱液；（4）调节洗脱液pH，脱色过滤得到脱色液；（5）调节脱色液pH，采用中低压分离柱对脱色液进行各组分单体分离，分别收集得到硫酸多粘菌素B各组分B1、B1

【技术实现步骤摘要】
一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体是一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法。

技术介绍

[0002]硫酸多粘菌素B(多粘菌素B)英文名：Polymyxin B Sulfate(Aerosporin)，系由多粘芽胞杆菌产生的一组由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性多肽类抗生素，于1947年被发现。除变形杆菌属外，硫酸多粘菌素B对几乎所有的革兰氏阴性细菌都有抗菌作用，多粘菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效。多粘菌素B抗菌谱对大肠埃希菌、肠杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯菌属流感杆菌等，特别是对铜绿假单胞菌属鲍曼不动菌属有高度敏感，并且对绿脓杆菌有高效，曾经是抗绿脓杆菌的首选药物，但是由于其毒副作用较大，只是局部用于敏感菌的眼、耳、皮肤、粘膜感染及烧伤绿脓杆菌感染。
[0003]近年来，随着超级细菌，即对几乎所有抗菌药物耐药的院内泛耐药菌的出现，临床治疗面临严重威胁。目前，耐多药革兰阴性杆菌感染，如铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌的感染，由于病原菌对许多抗菌药物存在天然耐药，且极易获得耐药性，成为治疗的难点。近期，除了替加环素批准用于治疗耐多药鲍氏不动杆菌(但该药对铜绿假单胞菌无效)外，就再也没有其他新研发的针对耐多药革兰阴性杆菌感染的药物了。多粘菌素作为治疗革兰阴性菌的最后一道防线再次受到重视。
[0004]由于硫酸多粘菌素B是目前对付超级细菌的有效药物，因而备受关注，但是，由于B1、B2、B3和B1
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I四个组分及其他杂质具有的肾毒性，严重影响了硫酸多粘菌素B的临床用药。
[0005]硫酸多粘菌素B为多组分产品，包括B1、B2、B3和B1
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I四个组分(结构式见附图1)以及其他杂质。USP/EP标准及中国药典规定硫酸多粘菌素B含量≥80％，并且对相关组分及杂质进行了规定，要求最大单杂≤3.0％、总杂≤17％、B3≤6.0％、B1
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I≤15％。从各国药典的要求可以看出，B1、B2、B3和B1
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I四个组分均为多粘菌素B的有效组分。
[0006]为了拓展硫酸多粘菌素的用途，有必要对其四个组分(B1、B2、B3、B1
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I)进行单独分离，得到高纯度高含量单一的组分后，对其肾毒性及抗菌性进行临床定量研究，获得明确数据后供临床指导使用，特别是注射用药。高纯度、高含量硫酸多粘菌素B1、B2、B3、B1
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I组分的获得，对于将来此类新药的开发将会提供帮助。
[0007]基于以上，当前对制备硫酸多粘菌素B单组分的方法以及适合大规模工业化生产的硫酸多粘菌素B单组分的方法存在必要性。
[0008]目前国内在硫酸多粘菌素B单组分提取和纯化方面的文献和专利较少。何凤云、薛蒙伟、黄淼等发表的《多粘菌素B中多粘菌素B1的制备方法研究》，采用反相制备液相色谱从多粘菌素B中分离得到了高纯度多粘菌素B1单体，采用的中高压制备色谱，上样量较少，只能制备毫克级样品，不能满足产业化硫酸多粘菌素B单组分需求；申请号为201210519331.7
的专利技术专利，公开了《一种在硫酸多粘菌素B中提取B1单组分的方法》是利用菌渣的特异性吸附从硫酸多粘菌素B溶液中直接提取多粘菌素B1单组分的方法，提取B1单组分的纯度在98.1
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98.5％之间，该方法只能够提取到B1组分，对于其它三个有效组分B2、B3和B1
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I无法实现提纯；申请号为201110390624.5的专利技术专利，《一种高纯度多粘菌素B的制备方法》公开了直接将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，采用高效液相色谱制备柱的方式分离纯化获得B1、B2组分，分离纯化后组分采用纳滤脱盐得到纯度在99.5％以上的多粘菌素B。其采用纳滤脱盐技术，对二价以及以上的盐去除效果差，产品含量很难达到99％。且其只分离纯化了B1、B2两个组分，没有分离B3和B1
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1两种组分。
[0009]鉴于现有技术存在的上述问题，研发一种适合大规模工业化生产的提取硫酸多粘菌素B单组分的方法具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的就是针对目前国内硫酸多粘菌素B单组分提取和纯化工艺存在的不能满足产业化需求、不能同时提取全部四种组分以及生产成本高等问题，研发一种从能同时发酵液中提取分离得到4种高纯度高含量硫酸多粘菌素B组分的方法，该方法具有成本低廉、适合大规模工业生产等优点。
[0011]本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0012]一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，包括以下步骤：
[0013](1)将发酵液用酸调节pH，通过陶瓷膜过滤后得到过滤液；所述发酵液是通过硫酸多粘菌素B生产菌株进行微生物发酵而得。
[0014](2)向过滤液中加入草酸，再加入碱液调节pH，再过滤除钙，得到除钙液；
[0015](3)将除钙液用阳离子交换树脂吸附、洗杂、洗脱，得到洗脱液；
[0016](4)将洗脱液用液碱调节pH，通过活性炭脱色，过滤得到脱色液；
[0017](5)调节脱色液的pH，采用上中低压分离柱对脱色液进行各组分单体分离，分别收集得到硫酸多粘菌素B各组分B1、B1
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I、B2和B3洗脱液；
[0018](6)将得到的各组分洗脱液分别加入液碱进行pH调节，结晶析出，过滤，对滤饼水洗除盐，得到各组分的结晶湿粉；
[0019](7)将得到的结晶湿粉用硫酸溶解分别得到多粘菌素B1、B2、B3和B1
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I硫酸盐溶解液；
[0020](8)将得到的各组分硫酸盐溶解液进行干燥，即得硫酸多粘菌素B各组分成品。
[0021]本专利技术中所述步骤(1)中的酸为1M盐酸溶液或1M硫酸溶液，调节pH的范围为1.5
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3.0，优选2.0
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2.5。
[0022]本专利技术中所述步骤(2)中采用的碱液为1
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2M的NaOH溶液调节pH值范围为3.0
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5.0，优选3.0
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3.5；过滤温度为15
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25℃。
[0023]本专利技术中所述步骤(3)中阳离子交换树脂，优选树脂型号为D001、D113、C105、C106中一种；所述树脂吸附产品量为30g/L
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100g/L，优选50g/L
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70g/L；所述洗杂溶剂为0.01
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0.05mol/L的硫酸水溶液，优选为0.02
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0.03mol/L的硫酸水溶液；所述洗脱溶剂为0.10
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0.40mol/L的硫酸水溶液，优选浓度为0.15
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0.30mol/L的硫酸水溶液。
[0024]本专利技术中所述步骤(4)中的活性炭为酸碳或中性碳，优选303或301酸性活性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将发酵液用酸调节pH，陶瓷膜过滤后得到过滤液；（2）向过滤液中加入草酸，再加入碱液调节过滤液的pH，再过滤除钙，得到除钙液；（3）将除钙液用阳离子交换树脂吸附、洗杂、洗脱，得到洗脱液；（4）将洗脱液用液碱调节pH，通过活性炭脱色，过滤得到脱色液；（5）调节脱色液的pH，采用上中低压分离柱对脱色液进行各组分单体分离，分别收集得到硫酸多粘菌素B各组分B1、B1
‑
I、B2和B3洗脱液；（6）将得到的各组分洗脱液分别加入液碱进行pH调节，结晶析出，过滤，对滤饼水洗除盐，得到各组分的结晶湿粉；（7）将得到的结晶湿粉用硫酸溶解分别得到多粘菌素B1、B2、B3和B1
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I硫酸盐溶解液；（8）将得到的各组分硫酸盐溶解液进行干燥，即得硫酸多粘菌素B各组分成品。2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的酸为1M盐酸溶液或1M硫酸溶液，调节pH的范围为1.5
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3.0，优选2.0
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2.5。3. 根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，其特征在于：所述步骤（2）中采用的碱液为1
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2 M的NaOH溶液调节pH值范围为3.0
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5.0，优选3.0
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3.5；所述过滤温度为15
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25 ℃。4. 根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，其特征在于：所述步骤（3）中阳离子交换树脂，优选树脂型号为D001、D113、C105、C106中一种；所述树脂吸附产品量为30 g/L
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100 g/L，优选50 g/L
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70 g/L；所述洗杂溶剂为0.01
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0.05 mol/L的硫酸水溶液，优选为0.02
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0.03 mol/L的硫酸水溶液；所述洗脱溶剂为0.10
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0.40 mol/L的硫酸水溶液，优选浓度为0.15
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0.30 mol/L的硫酸水溶液。5. 根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取高纯度高含量硫酸多粘菌素B单组分的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的活性炭为酸碳或中性碳，优选303或301酸性活性炭；所述活性炭的添加量为洗脱液中硫酸多粘菌B质量的5 %
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40 %，优选15 %
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30 %；所述脱色液用液碱调节pH值为2.0
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3.0，优选2.5
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3.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈腊英，袁卫东，
申请(专利权)人：黄石曼菲特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：