本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、乙酰辅酶Ａ、过氧化氢、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶Ａ－二硫还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及-一种异柠檬酸测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定
技术介绍
异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。 在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D 型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟 头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下变成a-酮戊二酸，在异 柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。 中华人民共和国国家标准，GB T1677卜1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D_异 柠檬酸的测定方法-紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料的总1)-异柠檬酸的测定。其测定原理异柠檬酸脱 氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型以NAD为辅酶的酶(ECl. 1. 1. 41)和要NADP 为辅酶的酶(ECl. 1. 1. 42)，两者催化同一反应。 异柠檬酸+NAD(P)+-: a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + ir 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相当于D-异拧檬酸盐的量。在波长34()nra处测定吸光度，确定样品中总 D-异柠檬酸的含量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法 (CoupleReaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处 吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时,本专利技术还将给出用以实现该方法的异 柠檬酸测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析 仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本专利技术异柠檬酸浓度测定方法如下 异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱颠:酶二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+辅酶A +氧 2辅酶A+辅酶辅酶A-二硫还原酶辅酶A- 二硫+还原型辅酶 这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41; ECl. 1. 1. 42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、辅酶A- 二硫还 原酶(CoA-disulfide reductase ;EC 1. 8. 1. 14)酶促反应比色终点法。异拧檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、辅酶A-二硫还原酶的作 用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收 峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上 升的程度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术异柠檬酸测定试剂(盒)较为理想缓冲液100,1/L稳定剂500鹏o:[/L辅酶3mmol/L异柠檬酸脱氢酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000U/L辅酶A- 二硫还原酶12000U/L乙酰辅酶A7咖ol/L过氧化氢12咖ol/L本专利技术的异柠檬酸测定试剂(盒)可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶J瞎酶A-二硫还原酶、乙酰辅酶A、过氧化氢。试剂(盒)可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢。 试剂2 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶A- 二硫还原酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶A- 二硫还原酶、乙酰辅酶A、过氧化氢在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂,直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰辅酶A、过氧化氢。 试剂2 缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、辅酶A- 二硫还原酶。 试剂3 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、辅酶A 二硫还原酶、乙酰辅酶A、过氧化氢 在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是 NADP'、 NAD'或thio-NAD'中的一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一 本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括 稳定剂 辅酶 异柠檬酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 辅酶A- 二硫还原酶 乙酰辅酶A 过氧化氢 100mmol/L 500mmol/L 3mraol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 7mmol/L12mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻千燥，制成千粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37°C,反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。 实施例二本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶乙酰辅酶A 过氧化氢 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷_盐酸缓冲液 稳定剂异柠檬酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶 辅酶A- 二硫还原酶 lOOmniol/L 50mmol/L 3mmol/L 7mmol/l 12mraol/L100mmol/L 50mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶,制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《().1，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为 2/20/5，反应方向为正反应(....匕升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下，检测J算出异柠檬酸的浓度大小主波长340nm吸光度上升的程度，从而； 实施例三本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法如下： 异柠檬酸＋辅酶 异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳＋酮戊二酸＋还原型辅酶 二氧化碳＋过氧化氢＋乙酰辅酶Ａ 丙酮酸氧化酶 丙酮酸＋辅酶Ａ＋氧 ２辅酶Ａ＋辅酶 辅酶Ａ－二硫还原酶辅酶Ａ－二硫＋还原型辅酶 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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