一种重组酵母脂肪酶的发酵制备方法，属于酶的基因工程技术领域。本发明专利技术将含有华根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１０２１脂肪酶编码基因ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１的重组酵母菌株ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏＲＣＬ种子培养，然后按５％～１０％接种量接种于含４０ｇ／Ｌ甘油和４ｍＬ／Ｌ微量元素ＰＴＭ↓［１］溶液的基础盐培养基ＢＳＭ中；通气搅拌培养，流加补料生长培养液，流加诱导培养液，收集发酵液，加入终浓度均为３％～６％的氯化钙和磷酸氢二钠作为酵母菌体絮凝剂，板框过滤，超滤浓缩，最终制备得到浓缩５～１０倍的液体脂肪酶制品；重组酵母发酵培养过程中脂肪酶的表达量可达到２０００Ｕ／ｍＬ发酵液，蛋白表达量为２．５ｇ／Ｌ，发酵液比活８００Ｕ／ｍｇ。
【技术实现步骤摘要】
，具体地说涉及一种重组毕赤酵母高 效表达来源于华根霉的脂肪酶的发酵制备方法。属于酶的基因工程
技术背景脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)全称Triacylglycero1 acylhydrolase，能够水解三酰 廿油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸廿油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于 水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用。因此，脂肪酶可以说 是专门在异相系统或者非水介质中油(或酯)与水的界面上催化的酶。通过控制反 应体系中水的含量，改变反应条件可以使水解反应向合成方向进行，这些反应 通常具有高度的区域或立体选择性。自然界中的脂肪酶广泛地存在于各种生物 体中，包括人类和植物。人体和其它动物体中，脂肪酶主要功能是对油脂进行 消化、吸收和修饰。在植物中，脂肪酶在茉莉酸防疫体系和病原体诱导的水杨 酸生成过程中起重要作用。在微生物中，脂肪酶则是用于对油脂的水解而生成 脂肪酸，脂肪酸再进入P-氧化途径提供能量，并且在微生物油脂的储存中也起到 一定的作用。微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度，并 适合于工业化大生产，所以微生物是脂肪酶的一个重要来源，其中根霉属 (及/7/zo/7iw sp.)微生物是脂肪酶的重要生产菌(Jaeger K E and EggertT, Curr Opin Biotech, 2002, 13:390-397)。在过去的十多年里，从根霉菌中分离到超过30种脂 肪酶，多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂。各种各样的微生物，包括细菌、 酵母和霉菌都能用于脂肪酶的生产，并且这些脂肪酶都广泛用于清洁剂、食品、 香料、手性医药中间体、生物材料和一些化学品的生产中(HasanF，etal. Enzyme and Microbial Technol， 2006, 39:235-251)。是什么原因导致了脂肪酶具有如此吸引力？德国科学家Jaeger等人认为原 因主要有四点1、它们通常有非常精确的化学选择性，位置选择性和立体选择 性；2、它们很容易就能大量被制备，因为许多微生物都能大量生产脂肪酶；3、 许多脂肪酶的结构已经研究清楚，这使得酶的理性改造变得更容易、更简单；4、 脂肪酶不需要辅因子，并且不会催化副反应(Jaeger KE and Eggert T. Current Opinion in Biotechnol， 2002, 13:3卯-397)。脂肪酶所催化的反应也不仅仅局限于 水解，在一定条件下还能催化酯化、转酯化、酯交换和氨解反应。因此脂肪酶 成为生物催化剂中研究最广泛的催化剂之一。然而在脂肪酶生物催化的工业生产过程中，催化剂脂肪酶是一个很大的限 制因素，自然条件下，菌株产脂肪酶量较低，利用常规育种方法难以满足工业 化生产的需要。因此研究人员把注意力集中到克隆和表达脂肪酶基因上，通过 基因表达调控来提高脂肪酶的活力。目前为止，国内外已报道了多个根霉脂肪酶的基因序列，根霉属主要包括 微抱根毒(/ /2z'zopw51 m/crc^sporiw)， 甸枝根毒(i Wzopw515to/omyb-)禾口米根霄 (朋/zops^y加e)三类，由于基因序列上微小的差异，分类学上将雪白根霉 (朋iz。/ms ivewj)，德氏根霉(朋/zo/ ws c/e/e附flr)，爪哇根毒(/ /^c;piwyavaz.cws) 禾口少根根霉(及/n!zo;ms fl^r/z/ztw)归为米根霉一类(Schipper M AA， Studies in Mycology, 1984， 25:1-19)， 目前已矛艮道了 i / /zo/ iw sto/omy^禾口 i /z/zopws o^yzae 脂肪酶基因，两者的脂肪酶基因同源性达到80%以上。曰本、德国先后用大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母成功表达米根霉 脂肪酶(/ Wzo戸sw^ae lipase, ROL)基因。虽然米根霉和德氏根霉脂肪酶在大 肠杆菌中有很好的表达，但这些脂肪酶只能以无活性的形式表达，还需要对重 组酶进行复性处理才能形成有活性的脂肪酶(Di Lorenzo M, et al. Appl Environ Microbiol, 2005,71:8974- 8977)。Kohno等用酿酒酵母(Sacc/zaraw少ces c^ev/Wae)ND-12B和高拷贝质粒 pJDB219成功构建了一个雪白根霉脂肪酶高表达系统，优化培养基成分后，发酵 液中重组脂肪酶酶活达到1600U/mL，为亲本的6倍，每升发酵液含有0.2 g-0.3 g 重组脂肪酶(Kohno M，etal. Protein Express Purif, 1999， 15: 327-335)。随着细 胞表面工程(cell surface engineering)的发展，Washida等以酿酒酵母为宿主，在 重组米根霉脂肪酶中添加一个连接肽，使脂肪酶连接到细胞壁上，从而使整个 细胞表面都有脂肪酶分布。这些酿酒酵母细胞能在以三油酸甘油酯为唯一碳源 的培养基上生长(Washida M， et al. Appl Microbiol Biotechnol， 2001， 56:681-686)。近年来，国内外越来越多的研究者利用真核宿主毕赤酵母(/^;^pww^)表达脂肪酶基因。Minning等在毕赤酵母中表达米根霉脂肪酶成熟肽(ROL)基 因，以triolein为底物测定摇瓶培养条件下诱导48h，上清重组脂肪酶酶活达到l 10 U/mL， 5 L发酵罐培养后酶活提高约5倍(Mi皿ing S， et al. J Biotechnol, 1998， 66: 147-156)。谭天伟等在毕赤酵母中表达少根根霉脂肪酶前导肽(rRAL)基因， 以橄榄油为底物测定摇瓶培养条件下诱导48 h，上清重组脂肪酶酶活达到18 U/mL， 5 L发酵罐培养后酶活提高约10倍(Niu WN， et al. Mol Biotechnol, 2006, 32: 73-81)。日本、德国对米根霉脂肪酶(i /z/zop^wy^e lipase, ROL)的基因序列和表 达做了比较深入的研究，米根霉脂肪酶由26个氨基酸信号序列(presequsece)、 97 个氨基酸前序列(prosequsence)和269个氨基酸成熟脂肪酶(matureROL)区域所组成。Takahash傳研究了前序列上相关区域的作用。研究表明前序列上的20号到 57号残基对米根霉脂肪酶的分泌和折叠起着十分重要的作用酶的分泌必需有 前序列的20号到37号残基，而经折叠形成活性脂肪酶必需有38号到57号残基 (Ueda M, et al. J Mol Catal B: Enzym， 2002， 17: 113-124)。综上所述，虽然针对脂肪酶基因的表达做了许多研究，但总体说来表达水 平还较低，如何提高脂肪酶的表达水平将是研究的难点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术中所述 脂肪酶基因来源于专利技术人从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到的一株高产脂肪 酶的华根霉(及/z/zop^c/n'm^) CCTCC M201021 ，申请公开号CN1443841A 已报道，本专利技术提供了一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵制备脂肪酶的方法，其特征是步骤为： 将含有华根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０１０２１脂肪酶编码基因ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的重组酵母菌株ＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏＲＣＬ种子培养，然后按５％～ １０％接种量接种于含４０ｇ／Ｌ甘油和４ｍＬ／Ｌ微量元素ＰＴＭ１溶液的基础盐培养基ＢＳＭ中； 通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度控制在２０％～６０％； 流加补料生长培养液：菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时ｐＨ受到闭环控 制，自动流加质量浓度２５％的工业氨水控制ｐＨ５～７，当发酵培养基中的底物甘油耗尽后，此时ＤＯ陡然上升，开始流加含１２ｍＬ／Ｌ的ＰＴＭ１的５００ｇ／Ｌ的甘油补料生长培养液；温度控制在２８℃； 流加诱导培养液：当细胞光密度ＯＤ６００达到６ ０～１２０后，流加补料生长培养液，维持饥饿状态约３０ｍｉｎ，彻底耗尽甘油，然后补入甲醇诱导培养液，体系中甲醇浓度控制在质量百分０．０５％～３％，继续培养２～５天，温度控制在２０～２８℃； 收集发酵液，加入终浓度均为３％～６％的氯化钙和 磷酸氢二钠作为酵母菌体絮凝剂，板框过滤，超滤浓缩，制备得到浓缩５～１０倍的液体脂肪酶制品； 所述培养基为： （１）种子培养基 ＢＭＧＹ培养基：蛋白胨２０ｇ／Ｌ，酵母提取物１０ｇ／Ｌ，ＹＮＢ １３．４ｇ／Ｌ，甘油２０ｇ／Ｌ， ５００×生物素２ｍＬ／Ｌ，ｐＨ６．０磷酸缓冲液１００ｍＬ／Ｌ；用５００ｍＬ的三角瓶培养，装液量１０％； （２）微量元素ＰＴＭ↓［１］溶液：ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ６ｇ／Ｌ，ＫＩ０．０８ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ↓［４］.Ｈ↓［２］Ｏ↓［ ３］ｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ０．２ｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］０．０２ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２０ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ６５ｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．５ｇ／Ｌ，生物素０．２ｇ／Ｌ，Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］５ｍＬ／Ｌ； （３）基础盐培养基ＢＳＭ：８５％Ｈ↓［３］ＰＯ↓［４］２６．７ｍＬ／Ｌ，ＣａＳＯ↓［４］０．９３ｇ／Ｌ，Ｋ↓［２］ＳＯ↓［４］１８．２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ１４ ．９ｇ／Ｌ，ＫＯＨ４．１３ｇ／Ｌ； （４）发酵培养基：用基础盐培养基ＢＳＭ配制成含４０ｇ／Ｌ甘油和４ｍＬ／Ｌ微量元素ＰＴＭ↓［１］溶液...
【技术特征摘要】
1、一种发酵制备脂肪酶的方法，其特征是步骤为将含有华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶编码基因SEQ IDNO1的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL种子培养，然后按5％～10％接种量接种于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM1溶液的基础盐培养基BSM中；通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度控制在20％～60％；流加补料生长培养液菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加质量浓度25％的工业氨水控制pH5～7，当发酵培养基中的底物甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加含12mL/L的PTM1的500g/L的甘油补料生长培养液；温度控制在28℃；流加诱导培养液当细胞光密度OD600达到60～120后，流加补料生长培养液，维持饥饿状态约30min，彻底耗尽甘油，然后补入甲醇诱导培养液，体系中甲醇浓度控制在质量百分0.05％～3％，继续培养2～5天，温度控制在20～28℃；收集发酵液，加入终浓度均为3％～6％的氯化钙和磷酸氢二钠作为酵母菌体絮凝剂，板框过滤，超滤浓缩，...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，喻晓蔚，王同春，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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