一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因及其应用，所述LpAGO4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；其对应的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。通过基于愈伤组织的农杆菌介导的稳定转化体系转化多年生黑麦草并进行表型分析，结果表明该基因具有降低叶绿素含量、促使叶片提前衰老的功能。LpAGO4基因的发现，为培育延缓叶片衰老的多年生黑麦草新品种提供了新的基因资源；同时该基因的敲除将显著延缓叶片衰老，延长草坪草等观叶植物的观赏期，降低栽培管理养护成本，该基因的应用具有重要的生产实践意义。因的应用具有重要的生产实践意义。因的应用具有重要的生产实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因及其应用


[0001]本专利技术涉及黑麦草叶片衰老调控方法领域，具体涉及一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因及其应用。

技术介绍

[0002]多年生黑麦草是一种在我国广泛应用的优良冷季型草坪草和牧草，具有株型美观、成坪快、耐修剪、牛羊喜食等优点。但是多年生黑麦草的抗逆性差，在高温、干旱、机械损伤等环境因素影响下叶片极易黄化，严重影响其在园林绿化中的观赏效果和作为饲草的营养品质。植物叶片中叶绿素降解是叶片黄化的关键因素之一。因此，对调控多年生黑麦草叶片衰老和叶片黄化的关键基因进行研究，对提升植物观赏品质和营养价值具有重要的意义。RNA介导的DNA甲基化(RdDM)是一种在非编码RNA分子引导下，使特定DNA序列发生甲基化的生物学过程。研究表明植物叶片衰老是一个受到多层次精细调控的高度复杂的过程，其涉及DNA甲基化、染色质调控和转录调控、转录后调控以及翻译和翻译后调控过程。然而，目前关于RdDM途径在叶片衰老过程中的具体调控机理却知之甚少。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因及其应用。
[0004]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0005]一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因，LpAGO4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
[0006]进一步的，LpAGO4基因的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
[0007]进一步的，LpAGO4基因的启动子序列为SEQ ID No.3所示。
[0008]进一步的，调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因在延缓黑麦草叶片衰老中的应用。
[0009]进一步的，具体应用方法为通过基因工程方法敲除黑麦草的LpAGO4基因。
[0010]本专利技术的有益效果为：本专利技术首次鉴定和克隆了一个调控多年生黑麦草叶片衰老的关键基因LpAGO4，该基因是RdDM途径的关键基因。该基因作为控制多年生黑麦草叶片衰老的负向调控因子，该基因的功能解析为了解禾本科草坪草叶片衰老调控的分子机理提供了关键证据。该基因的发现，为多年生黑麦草等草坪草品质改良提供了新的基因资源。
[0011]多年生黑麦草等草坪草叶片衰老的关键基因AGO4在植物育种中的应用。利用农杆菌介导的遗传转化技术，将该基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)在植物中超量表达，可以加速叶片衰老，显著降低叶绿素含量。利用基因编辑技术，在多年生黑麦草等草坪草中敲除该基因，将大大延缓叶片衰老，延长草坪草等观叶植物的观赏期，提高植物品质，降低栽培管理养护成本，该基因的应用具有重要的生产实践意义和应用潜力。
附图说明
[0012]图1为原始植物超量表达载体pCAMBIA1301U结构示意图。
[0013]图2为多年生黑麦草LpAGO4超量表达阳性株系鉴定结果，其中A图为:PCR胶图；B图为RT
‑
qPCR结果；
[0014]图3中A图为多年生黑麦草LpAGO4超量表达阳性株系叶片衰老表型；B图为多年生黑麦草LpAGO4超量表达阳性株系叶片叶片黄化率；C图为多年生黑麦草LpAGO4超量表达阳性株系叶片电导率；D图为多年生黑麦草LpAGO4超量表达阳性株系叶片总叶绿素含量。
具体实施方式
[0015]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0016]一、多年生黑麦草叶片衰老关键基因AGO4及其启动子的获得
[0017](1)分离多年生黑麦草叶片衰老关键基因AGO4
[0018]从多年生黑麦草中分离获得AGO4基因，其序列如SEQ ID No.1所示，以多年生黑麦草叶片cDNA为模板扩增所需片段，其具体步骤如下：
[0019]根据前期转录组数据预测的AGO4序列设计其扩增引物对：
[0020]AGO4正向引物：5
’‑
CTCCTTCGCCATTTTACCTTCTATC
‑3’
，
[0021]AGO4反向引物：5
’‑
GCAGATTCTTCACCACAATACCAAC
‑3’
。
[0022]以多年生黑麦草叶片提取的RNA反转录后的cDNA为模板和上述AGO4基因的引物对进行PCR扩增，
[0023]PCR体系：
[0024]2×
Phanta Flash Master Mix20μl正向引物2μl反向引物2μl模板2μlddH2O14μl合计40μl
[0025]PCR的条件：
[0026][0027]纯化得到扩增产物，即AGO4基因；将扩增获得的AGO4基因连入18
‑
T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因；将该克隆被命名为18
‑
AGO4质粒。
[0028](2)分离AGO4基因的启动子片段
[0029]利用FPNI
‑
PCR技术，以多年生黑麦草叶片的gDNA为模板扩增启动子片段，其具体步骤如下：
[0030]根据AGO4基因的DNA序列，在AGO4基因靠近N端区域设计FPNI
‑
PCR扩增的特异引物：
[0031]AGO4
‑
SP1：5
’‑
GTCCTCTAATGGCTTGCGCGA
‑3’
，
[0032]AGO4
‑
SP2：5
’‑
AAGTCTTCGTCTGGAACGGCCTC
‑3’
，
[0033]AGO4
‑
SP3：5
’‑
GTCCCAATATCCTCCAGAACCACAG
‑3’
。
[0034]以多年生黑麦草叶片提取的gDNA为模板和上述FPNI
‑
PCR扩增的特异引物以及FPNI
‑
PCR体系的兼并引物进行PCR扩增，
[0035]PCR体系：
[0036][0037][0038]PCR的条件：
[0039][0040][0041]纯化得到扩增产物，即1907bp的AGO4基因的启动子序列(SEQ IDNo.3)；将扩增获得的AGO4基因连入18
‑
T载体，筛选阳性克隆并测序，获得所需的启动子片段。
[0042]二、AGO4基因超量表达载体的构建及对多年生黑麦草的遗传转化
[0043]为了能更好地阐明AGO4基因的功能，将该克隆的基因序列在多年生黑麦草中超量
表达，从转基因植株表型观测和生理指标测定来验证其功能。具体步骤如下：
[0044](1)AGO4基因超量表达载体的构建
[0045]用同源重组法将实施例1中得到的AGO4的CDS序列构建到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因，其特征在于，LpAGO4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因，其特征在于，LpAGO4基因的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的调控叶片衰老的黑麦草LpAGO4基因，其特征在于，LpAGO4基因的启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：产祝龙，孙天晓，王艳平，向林，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：