探测发射光的方法、探测设备和激光扫描显微镜技术

本发明专利技术涉及用于在激光扫描显微镜中探测发射光、尤其是来自至少一种荧光染料的荧光的方法，其中，利用成像光学器件将来自样品的发射光引导到位于图像平面中的具有多个像素的二维矩阵传感器上，其中，利用矩阵传感器以空间超采样的方式探测探测点分布函数。该方法的特征在于，利用色散装置尤其是在色散方向上对来自样品的发射光进行光谱分解，利用矩阵传感器对经光谱分解的发射光进行光谱分辨式探测，并且在评估由像素区域的像素测得的强度时，至少针对这些像素中的一些像素取消光谱分离。在另外的方面中，本发明专利技术涉及用于在激光扫描显微镜中以光谱分辨方式探测发射光的探测设备，并涉及激光扫描显微镜。涉及激光扫描显微镜。涉及激光扫描显微镜。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】探测发射光的方法、探测设备和激光扫描显微镜


[0001]在第一方面，本专利技术涉及一种根据权利要求1的前序部分所述的用于在激光扫描显微镜中探测发射光、尤其是来自至少一种荧光染料的荧光的方法。在另外的方面，本专利技术涉及一种根据权利要求16的前序部分所述的用于在激光扫描显微镜中探测发射光的探测设备和一种根据权利要求27的前序部分所述的激光扫描显微镜。

技术介绍

[0002]按类属的用于在激光扫描显微镜中探测发射光、尤其是来自至少一种荧光染料的荧光的方法例如在M.Castello等人的“Image Scanning Microscopy with Single
‑
Photon Detector Array(用单光子探测器阵列进行图像扫描显微镜检查)”，bioRxiv，doi：http://dx.doi.org/10.1101/335596(以下称：[2019年Castell等人])公开。在此，利用成像光学器件将来自样品的发射光引导到位于图像平面中的二维矩阵传感器上，该二维矩阵传感器具有多个像素，并且利用矩阵传感器以空间超采样的方式探测探测点分布函数。
[0003]同样在[2019年Castell等人]中公开了一种按类属的用于在激光扫描显微镜中探测发射光的探测设备。按类属的探测设备具有在图像平面内的具有多个像素的二维矩阵传感器，以用于以空间超采样的方式探测来自样品的发射光的探测点分布函数，以及具有用于将发射光引导到二维矩阵传感器上的成像光学器件。
[0004]同样在[2019年Castello等人]中描述了一种按类属的激光扫描显微镜，并且其具有以下部件：用于发出激发光的光源、尤其是激光器；具有显微镜物镜的激发光路，其用于将激发光引导到待检的样品上或引导到其中；在激发光路中的扫描装置，其用于扫描样品上的至少一个照明斑点；探测光路，其用于将从样品射出的发射光、尤其是荧光引导到探测单元上；主分色器，其用于将激发光和发射光分开；探测单元，其用于检测发射光；控制和评估单元，尤其是PC，其用于驱控光源并用于评估从探测单元得到的测量数据。
[0005]在生物医学研究中，共焦激光扫描显微镜(LSM)在过去的几十年里已经确立了自己作为强大工具的地位，这是因为它们除了对发荧光的生物样品进行纯粹的成像之外，还支持许多基于图像的、相关联的或统计学上的实验和分析。这种能力的主要原因是，利用LSM可以用适度的仪器技术方面的花费同时测量多种染料。为此已知有许多解决方案。例如，可以利用二色性滤光片将光束分裂成不同的部分光束，然后将这些部分光束分别例如输送给作为传感器的光电倍增管(英文：Photomultiplier Tube
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PMT)。而组件是更灵活的，这些组件利用光栅或棱镜对发射光进行光谱色散，以便然后利用行传感器探测光谱。不期望的光谱范围可以利用传感器前面的能运动的光阑灵活地且依赖于染料地被阻断。此外，也已知有如下解决方案，其中，例如利用镜面反射的光阑来限定光谱带，然后将这些光谱带输送给不同的PMT。在这里和下文中，术语“染料”不仅包括合成染料而且还包括发荧光的蛋白质。此外，还应包括内在发射的结构。例如，许多生物结构在确定的波长的激光射入的情况下将发光，于是这例如被称为自发荧光。
[0006]虽然在大约30年前就有理论上描述的但直到2014年才利用蔡司公司的LSM880实
现商业化的共焦显微镜系统的创新是所谓的图像扫描显微镜(image scanning microscopy)(ISM；http://www.gattaquant.com/files/en_wp_airyscan
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detector.pdf)。它基于利用类似相机的传感器以超采样的方式测量探测点分布函数，并且一方面能够实现尽管针孔开放，但仍达到共焦的分辨率极限，并且另一方面经由对探测的内在并行化明显提高了系统的灵敏度。然而，如今在LSM980中实施的解决方案一方面是非常昂贵的，这是因为基于光纤的图像转换(从2D到1D)与GaAsP
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PM
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行探测器相结合。另一方面，因此严重限制了可以用于对点分布函数(PSF)进行超采样的像素数量。在具体情况中，正好是32个像素。因此，这些传感器只能有意义地被用在借助二色性滤光片来限定光谱通道的组件中，并且在这些组件中还需要光学变焦，利用该光学变焦，使得依赖于所选物镜(更准确地说是光导率和NA/M比率)和波长的PSF被引导到传感器。此外，这种探测器技术的单件成本几乎不允许每个仪器安装一个以上的探测器。
[0007]在传感器方面，近年来在所谓的SPAD阵列或SPAD相机(SPAD＝Single
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photon avalanche diode，单热子雪崩二极管)领域中已经呈现出快速发展。原则上，这些相机能够实现对像素进行独特激活，其中，一个像素在此由单独的单光子雪崩二极管实现。此外，像素可以在所谓的盖革模式下运行，从而在面传感器上可以进行光子计数。因此，使得所读取的信号是立即数字化的，这就能够实现极高的在1MHz左右的范围内的帧频。此外，SPAD相机不具有读取噪声。读取噪声尤其发生在其他传感器上，如sCMOS传感器或CCD，并随着高读取率而强烈增加。EM
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CCD采用靠近传感器的放大机制，以便提高信号超过读取噪声，并因此原则上可以成为单光子敏感。然而，在此引入了显著的放大噪声(其也被称为过量噪声；乘法噪声)，该放大噪声使传感器的有效灵敏度减半。此外，在像素数量更高的情况下从根本上限制了所能实现的速度。sCMOS相机实现了0.3e范围内的较低的读出噪声，这原则上允许利用这些相机进行光子计数。
[0008]由于帧频在MHz范围内，使得作为用于LSM的传感器的SPAD相机已经变得很有意义，其像素停留时长在1μs范围内。例如，利用这样的相机以传感器分辨率为512
×
128个像素在数据深度为1bit的情况下实现了156kfps(fps＝frames per second，帧每秒)。这相当于约10Gbit的数据速率。这意味着，具有大约1000
×
6个像素的行传感器甚至应该能在1bit数据深度的情况下实现1Mfps的帧频。目前，这些限制还没有达到根本上的极限，而是更确切地说在技术上由巨大的数据速率来确定。在只有一个bit的数据深度的情况下，能实现的速度大约相当于死区时间的倒数，并因此位于10MHz的范围内。然而，对于上面的示例，这将相当于100Gbit/s的数据速率。

技术实现思路

[0009]可以被视为本专利技术的一个任务是，提供一种上述类型的方法，该方法能特别多样性地使用。此外，还应说明一种合适的探测设备和一种激光扫描显微镜。
[0010]该任务通过具有权利要求1的特征的方法、具有权利要求13的特征的探测设备和具有权利要求23的特征的激光扫描显微镜来解决。
[0011]根据本专利技术的方法的有利的变体以及根据本专利技术的探测设备的和根据本专利技术的显微镜的优选实施例将在下文中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于在激光扫描显微镜中探测发射光(28)、尤其是来自至少一种荧光染料的荧光的方法，其中，利用成像光学器件(48)将来自样品(S)的发射光(28)引导到位于图像平面(56)中的具有多个像素(51)的二维矩阵传感器(50)上，其中，利用所述矩阵传感器(50)以空间超采样的方式探测探测点分布函数，其特征在于，利用色散装置(40)尤其是在色散方向(41)上对来自样品(S)的发射光(28)进行光谱分解，利用所述矩阵传感器(50)对经光谱分解的发射光(42、44、46、47)进行光谱分辨式探测，并且在评估由像素区域(71、72)的像素(i,j)测得的强度(I
i,j
；g
i,j
)时，至少针对这些像素(i,j)中的一些像素取消光谱分离。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据利用所述矩阵传感器(50)测得的光谱来识别至少一个被分配给染料的发射的像素区域(71、72)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，为了确定所述矩阵传感器(50)上的发射光的光谱强度分布(sp(λ)、sp
i
)，通过如下方式确定属于确定的波长(λ
i
)的强度值(sp(λ)、sp
i
)，即，将所述矩阵传感器(50)的垂直于色散方向(41)的列(i)的多个像素(i,j)的测量数据(I
i,j
；g
i,j
)进行求和，尤其是所述矩阵传感器(50)的垂直于色散方向(41)的列(i)的所有像素(i,j)的测量数据进行求和。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，为了识别所述像素区域(71、72)，在所获知的光谱分布中自动化搜索最大量(mx1、mx2)和最小量(mi)，并且基于所找到的最大量(mx1、mx2)和最小量(mi)向用户建议用于计算确定的染料的点分布函数的光谱边界，或基于所找到的最大量(mx1、mx2)和最小量(mi)自动规定光谱边界。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述像素区域(71、72)在所述矩阵探测器(50)上重叠，并且对由各个像素测得的强度执行光谱解混。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，针对至少一种荧光染料确定探测点分布函数。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，将由多个利用激发光(14)同时照射在样品(S)上的点射出的发射光(28)同时引导到所
述矩阵传感器(50)上并进行评估。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述矩阵传感器(50)在光子计数模式下运行。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，为了针对像素区域(71、72)的各个像素(i,j)取消光谱分离，在考虑到属于像素区域(71、72)的染料的发射光的光谱强度分布(sp(λ)、sp
i
)的情况下并在考虑到所述矩阵传感器(50)上各个光谱部分的空间强度分布(I
caIi
)的情况下，使由这些像素(i,j)测得的强度值(I
i,j
)相互抵消。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将如下强度分布(I
cali
)作为各个光谱部分的空间强度分布使用：所述强度分布由垂直于色散方向(41)的列(i)的像素(i,j)测得，尤其是由在各自的像素区域(71、72)中测得最高强度的那个列(i)的像素测得。11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，为了针对像素区域(71、72)的各个像素(i,j)取消光谱分离，将由所述像素(i,j)测得的强度值(g
i,j
)分配给图像平面(56)中的相对于各自的像素(i,j)移位了的位置(像素再分配)，其中，移位矢量(d
i,j
)依赖于各自的像素(i,j)的位置并依赖于属于该位置的波长(λ)。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，针对确定的像素(i,j)的移位矢量(d
i,j
)的不依赖于波长的部分通过将从参考像素(12,3)到有关像素(i,j)的矢量(g
i,j
)的矢量分量以再分配系数、尤其是以
‑
1/2进行缩放来获得。13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，在执行像素再分配后得到的探测点分布函数在色散方向(x、41)上与垂直于色散方向(y)基本上具有相同的形状。14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，属于与样品结构相配属的波长范围的移位矢量(d
i,j
)通过评估多个扫描图像的相位相关性来确定。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，利用所述矩阵传感器(50)、例如利用所述矩阵传感器(50)的一些像素并且尤其是利用所述矩阵传感器(50)的每个单像素执行时间分辨式测量，用以确定染料的荧光寿命。16.用于在激光扫描显微镜中探测发射光的探测设备，所述探测设备尤其是用于执行根据权利要求1至15中任一项所述的方法，所述探测设备
具有在图像平面(...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：