改进的腺相关病毒基因治疗载体制造技术

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的腺相关病毒基因治疗载体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月25日提交的美国临时系列No.63/043,837的权益，其全部内容在此引入本申请。

技术介绍

[0003]腺相关病毒(AAV)是一种依赖性细小病毒(dependo
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parvovirus)。病毒的复制取决于被感染的细胞是否被共感染有辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒。
[0004]AAV在人类和其他灵长类动物中高度流行。已从各种组织样本中分离出若干血清型。
[0005]已经分离并研究了超过12种AAV天然血清型和超过100种AAV变体，并将它们应用为基因递送载体，并且不断产生新的变体来改进AAV的基因递送。研究最多的AAV是在人类细胞中发现的血清型2、3、5、6、9和12，以及在非人类灵长类细胞中发现的血清型1、4、7、8、10和11。国际病毒分类学委员会将这些不同的血清型分为两大类：A类和B类。A类包括例如血清型
‑
1、
‑
2、
‑
3和
‑
4，而B类则包括血清型
‑
5。除灵长类动物外，AAV还分离自其他物种，如马、牛、鸡、蛇、蜥蜴和山羊。
[0006]每种血清型都有一定程度的组织特异性。例如，血清型6能有效感染人类心脏细胞，而血清型8能有效感染人类肝脏和骨骼肌细胞。
[0007]衣壳决定了血清型，也因而决定了组织特异性。AAV衣壳蛋白含有12个高度可变的表面区域。大多数变异发生在三重近端峰上。<br/>[0008]所有已知血清型的基因组都有相似的组织结构。例如，血清型2(AAV2)的基因组有4679个碱基。AAV2基因组的两端侧翼是145个碱基的T型结构，即末端反向重复序列(ITR)。ITR是基因组复制、第二链合成、衣壳化和将病毒基因组插入人类基因组所必需的。在AAV2中，基因组的复制是由两个大rep蛋白Rep78和Rep68介导的。小Rep蛋白，Rep52和Rep40，是将AAV基因组的正链或负链包装在预先形成的空衣壳中所必需的。
[0009]cap基因表达3种衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3。它通过选择性剪接、使用非
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ATG起始密码子、重叠阅读框来实现。组装激活蛋白(AAP)，通过VP2/3阅读框的读框移位表达，将VP蛋白靶向于核小体。这对于衣壳组装是必需的。
[0010]野生型AAV衣壳是二十面体。它是由60个VP蛋白分子组成。野生型衣壳VP1：VP2：VP3比例为1：1：10。因此，VP3通常形成衣壳的“核”。
[0011]在野生型腺病毒和野生型AAV(wt
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AAV)共同感染Hela细胞的情况下，研究了AAV的细胞内区室化(compartmentalization)，表明核小体参与了衣壳组装的启动，而DNA包装发生在核质内。在后期，Rep蛋白在核的外周富集。可以观察到组装好的AAV衣壳与AAP共同定位在细胞核、核小体中或聚集在核膜周围。
[0012]AAV被认为是一种有吸引力的潜在基因治疗载体。然而，AAV的充分治疗应用面临着若干障碍。例如，在体外的商业生产环境中，优选将经感染和/或转染的生产者细胞培养至少72小时或更长时间，以增加病毒的产生量。然而，AAV在制造过程中会迅速降解。例如，
虽然优选将经感染的生产者细胞培养至少72小时，以确保大量收获病毒，但血清型2和8在不到72小时内就会降解，故降低了感染性病毒的最终产量。
[0013]可以通过在感染后仅24小时内从生产者细胞中收获病毒来克服这一问题。虽然这减少了已完成的病毒的降解，但在过早地停止病毒复制时，也减少了病毒的产生量。
[0014]因此，本领域仍然需要提供能够以足够的量制备高质量且稳定的AAV，特别是用于基因治疗的AAV的方法。

技术实现思路

[0015]本公开提供了以下优选的实施方式。然而，本专利技术不限于这些实施方式。
[0016]在一个方面，本公开了提供了一种腺相关病毒基因组，其具有使膜相关辅助蛋白(MAAP)mRNA翻译启动密码子失活，或引入至少一个终止密码子以终止全长野生型MAAP的翻译的突变。
[0017]在另一方面，本公开提供了一种腺相关病毒基因组，其具有减少全长野生型MAAP表达的突变。
[0018]在优选的实施方式中，维持了VP1的表达。
[0019]在另一方面，本公开提供了一种腺相关病毒基因组，其转录为MAAP mRNA，所述基因组具有使MAAP mRNA相对于野生型MAAP mRNA发生改变的突变，所述改变选自：将MAAP翻译启动密码子变为非启动密码子的序列，和在MAAP mRNA中创建至少一个终止密码子；其中所述突变不阻止来自所述基因组的VP1表达。
[0020]在优选的实施方式中，所述突变使所述MAAP的翻译启动密码子失活和/或引入至少一个终止密码子以终止全长野生型MAAP的翻译。
[0021]在优选的实施方式中，所述突变使所述MAAP的翻译启动密码子失活。
[0022]在优选的实施方式中，所述突变引入至少一个终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106或110对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
[0023]在优选的实施方式中，所述突变引入至少一个终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11从残基编号9至110，更优选从残基编号39至103对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
[0024]在优选的实施方式中，所述突变引入至少一个终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9、33、39、47、65、90、100、106或110对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
[0025]在优选的实施方式中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9、33、39和/或47对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
[0026]在优选的实施方式中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9或残基编号33、39和47对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
[0027]在优选的实施方式中，所述基因组选自由以下项组成的组：天然存在的血清型和非天然存在的血清型。
[0028]在优选的实施方式中，所述基因组选自血清型1的基因组、血清型2的基因组、血清型5的基因组、血清型6的基因组、血清型8的基因组、血清型9的基因组、血清型10的基因组
和非天然存在的血清型。
[0029]在优选的实施方式中，所述基因组选自血清型1的基因组、血清型2的基因组、血清型6的基因组、血清型7的基因组、血清型8的基因组和血清型10的基因组。
[0030]在优选的实施方式中，所述基因组包括血清型1、2、5、6、8或9的基因组。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒基因组，其具有减少全长野生型膜相关辅助蛋白(MAAP)的表达的突变，但仍维持VP1的表达。2.一种腺相关病毒基因组，其转录为MAAP mRNA，所述基因组具有使MAAP mRNA相对于野生型MAAP mRNA发生改变的突变，所述改变选自：将MAAP翻译启动密码子变为非启动密码子的序列，和在MAAP mRNA中创建至少一个终止密码子；其中所述突变不阻止来自所述基因组的VP1表达。3.一种腺相关病毒基因组，其具有使MAAP mRNA翻译启动密码子失活，和/或引入至少一个终止密码子以终止全长野生型MAAP的翻译的突变。4.权利要求3所述的腺相关病毒基因组，其具有使MAAP mRNA翻译启动密码子失活的突变，并进一步包括至少一个引入至少一个终止密码子以终止全长野生型MAAP的翻译的突变。5.权利要求1或2所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变使所述MAAP的翻译启动密码子失活和/或引入至少一个终止密码子以终止全长野生型MAAP的翻译。6.权利要求1至5中任一项所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入至少一个终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11的残基编号9至110，更优选残基编号39至103对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。7.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入至少一个终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106或110对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。8.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号9对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。9.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号33对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。10.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号39对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。11.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号47对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。12.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号33、39和47对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。13.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号65对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。14.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号90对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。15.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号100对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。16.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号103对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。17.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号105对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。
18.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号106对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。19.权利要求6所述的腺相关病毒基因组，其中，所述突变引入终止密码子，以在与MAAP多肽共有序列SEQ ID NO.11残基编号110对齐的多肽残基处终止MAAP多肽的翻译。20.权利要求1至19中任一项所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组选自由以下项组成的组：天然存在的血清型和非天然存在的血清型。21.权利要求20所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组是非天然存在的血清型。22.权利要求20所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组是天然存在的血清型。23.权利要求22所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组包括血清型2的基因组。24.权利要求22所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组包括血清型5的基因组。25.权利要求22所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组选自血清型6的基因组和血清型8的基因组。26.权利要求22所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组选自血清型1的基因组和血清型9的基因组。27.权利要求22所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组选自血清型1的基因组、血清型2的基因组、血清型5的基因组、血清型6的基因组、血清型8的基因组和血清型9的基因组。28.权利要求21所述的腺相关病毒基因组，其中，所述基因组包括非天然存在的血清型。29.权利要求2至28中任一项所述的腺相关病毒基因组，其中，所述VP1肽序列相对于野生型未改变。30.权利要求2至28中任一项所述的腺相关病毒基因组，其中，所述VP1肽序列含有突变。31.权利要求2至28中任一项所述的腺相关病毒基因组，其中，所述MAAP和VP1肽序列各自与野生型有至少80％的同源性。32.权利要求31所述的腺相关病毒基因组，其中，所述MAAP和VP1肽序列各自与野生型有至少90％的同源性。33.一种腺相关病毒基因组，其不表达具有与MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11的任何33个连续残基有至少50％同源性的一级氨基酸序列的多肽。34.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述33个连续残基包括MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基93至97。35.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述33个连续残基包括MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基107至119。36.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述33个连续残基包括MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基1至30。37.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述腺相关病毒基因组不含任何与MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基1至33有至少60％同源性的序列。38.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述腺相关病毒基因组不含任何与MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基1至39有至少60％同源性的序列。
39.权利要求33所述的腺相关病毒基因组，其中，所述腺相关病毒基因组不含任何与MAAP共有多肽序列SEQ.ID NO.11残基1至47有至少60％同源性的序列。40.权利要求33所述的腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡里，
申请(专利权)人：辉凌企业有限公司，
类型：发明
国别省市：