稳定性改善的重组肉毒毒素轻链蛋白组合物制造技术

本公开涉及含有稳定性改善的重组肉毒毒素蛋白的组合物。本公开的组合物包含糖醇作为稳定剂。更具体地，本公开提供了一种组合物，其包含A型肉毒毒素轻链蛋白或其功能性片段，并且包含碳原子的个数为6个以下和/或在20℃下在水中的溶解度为150mg/mL以上的糖醇作为稳定剂。本发明专利技术的组合物通过稳定剂可以充分确保肉毒毒素蛋白的稳定性，同时发挥将重组肉毒毒素轻链蛋白的生物学活性保持在可用水平的效果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定性改善的重组肉毒毒素轻链蛋白组合物


[0001]本申请主张基于2020年9月29日申请的韩国专利申请第10
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2020
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0127249号的优先权，该申请的说明书和附图中公开的所有内容均援用于本申请。
[0002]本公开涉及改善重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定性的组合物。

技术介绍

[0003]肉毒毒素(botulinum toxin)是厌氧菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的多肽产物，是神经毒素的一种。该毒素通过阻断神经递质乙酰胆碱在哺乳类神经肌肉接头部(neuro muscular junction)的突触前释放而引起肌肉麻痹。
[0004]利用将没有人体副作用的用量以下作为注射药使用时，只能使注射部位的肌肉部分麻痹的原理，肉毒毒素在治疗不随意肌运动障碍方面得到治疗学应用。不随意肌运动障碍包括斜视、特发性眼睑痉挛、半侧颜面、斜颈、口下颌骨肌张力异常、痉挛性发声障碍、以及多种类型的肌肉痉挛及发作。
[0005]肉毒毒素近年来被用于麻痹眼角、眉间、额头等处形成皱纹的肌肉，从而非外科地减少颜面上的皱纹，也被用于缩小毛孔、粉刺、赋予弹力、缓解方下巴等审美、美容学领域。
[0006]肉毒毒素分为8种神经毒素，其中7种(A、B、C、D、E、F、G)可诱发神经麻痹。
[0007]肉毒毒素的大小约为150kDa，除肉毒毒素蛋白外，还由非毒素蛋白(non
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toxin)的复合体构成。每个复合体的大小根据毒素型的种类而最大生成至900kDa。据悉，作用形式和对象、活性时间等根据肉毒毒素型而改变，其中A型肉毒毒素是致命的生物学作用剂之一。
[0008]无论毒素型如何，肉毒毒素的分子机制似乎相似。肉毒毒素表达为一个多肽，表达后通过重组过程分为约100kDa的重链(Heavy chain，H链)和约50kDa的轻链(Light chain，L链)。再次，H链和L链通过二硫键连接。尽管根据肉毒毒素型具有不同的靶标，但共同的是H链与神经细胞的受体结合，通过内吞作用(endocytosis)形成包含毒素的内体(endosome)。通过这种内体允许肉毒毒素进入内部。L链进入细胞后逃出内体，切割细胞质内的SNARE蛋白，抑制乙酰胆碱分泌，从而表现出肌肉麻痹效果。
[0009]一般来说，蛋白质制剂容易因蛋白质的变性、凝集等而使稳定性降低。这些蛋白质制剂的不稳定性随着蛋白质制剂的储存时间的延长而增加。在蛋白质制剂的剂型化中，主要目的是保持蛋白质的溶解度、稳定性、生物活性度等。特别是，蛋白质制剂中酶根据它们的三维结构，生物活性度会大幅改变。将纯化的肉毒毒素结晶用生理盐水或水稀释时，生物学活性和药剂学特性丧失。另外，已知在40℃以上的温度下容易变性。即，公知如果没有合适的稳定剂，则肉毒毒素的毒性会被迅速清除。
[0010]以药剂学目的流通的肉毒毒素通常是包含非
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毒素蛋白(non
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toxin protein)和肉毒毒素蛋白分子的毒素复合体。非
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毒素蛋白在毒素复合体中起到稳定肉毒毒素分子、保护其免于变性从而保护肉毒毒素活性的作用。为了以化妆料的目的使用肉毒毒素，必须具备弱毒化(toxicity attenuation)过程和皮肤渗透性。因此，需要开发一种组合物，其不是与非
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毒素蛋白一起的毒素复合体形式而是仅通过L链来保持肉毒毒素的活性。

技术实现思路

[0011]技术课题
[0012]肉毒毒素的轻链是一种能够水解肽键的内肽酶(endopeptidase)。在A型肉毒毒素的情况下，切割SNARE蛋白中的SNAP
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25。因此，可以说轻链单独也可以抑制神经细胞的乙酰胆碱分泌。着眼于此，试图开发具有肌肉麻痹效果的仅具有肉毒毒素轻链的组合物，优选地试图以能够经皮传递的形式开发。
[0013]因此，本公开要解决的课题是提供一种含有重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定组合物。
[0014]特别是，本公开旨在进一步提供一种组合物，其不仅在冷藏条件下而且在室温下长时间储存时也保持肉毒毒素的内肽酶(endopeptidase)活性。更优选地，本公开旨在提供一种组合物，其作为消除使用上的不便的制剂形式，是液态形式而非冻干形式。
[0015]技术方案
[0016]本专利技术人发现了通过特定的稳定剂充分确保重组肉毒毒素轻链蛋白的稳定性，同时将重组肉毒毒素轻链蛋白的生物学活性保持在可用水平的惊人效果，从而完成了本专利技术。
[0017]具体地，本专利技术人试图通过在含有重组肉毒毒素轻链蛋白的组合物中包含糖醇、多元醇、高分子化合物、表面活性剂、抗氧化剂等用于蛋白质稳定化的多种稳定剂中的任一种以上来制备在室温下蛋白质稳定性增强的组合物。然而，确认了重组肉毒毒素轻链蛋白稳定性根据稳定剂的种类而显著不同。
[0018]在各种蛋白质稳定剂中，只有糖醇(Sugar alcohol)显著增强了A型肉毒毒素轻链蛋白或其片段(具有基本相同功效的片段)的稳定性，本专利技术人确认了这些意想不到的实验结果，从而完成了本专利技术。
[0019]本专利技术的糖醇是典型地衍生自糖的有机化合物，并且是每个碳原子上附着一个羟基(
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OH)的物质。链的长度根据碳数而多种多样，并且根据羟基的方向存在多种异构体。当糖醇包含多个羟基时，可以归类为多元醇(Polyol)，但在本说明书中，将多元醇和糖醇区分开来，并且将多元醇定义为除糖醇外的具有羟基的物质。
[0020]本公开的一个方面提供了一种包含A型肉毒毒素轻链蛋白或其片段和稳定剂的组合物，其中稳定剂是糖醇。
[0021]优选地，本公开的一个方面的A型肉毒毒素轻链蛋白是包含序列号:1的448个氨基酸序列的A型肉毒毒素轻链蛋白。在本公开的一个优选方面，本专利技术的A型肉毒毒素轻链蛋白由序列号:1组成。
[0022]在本公开的一个方面，A型肉毒毒素轻链蛋白除了轻链蛋白氨基酸序列之外，还可以包含额外的氨基酸序列，用于生产蛋白质、纯化蛋白质等目的。例如，本专利技术的A型肉毒毒素轻链蛋白可以在序列号:1的氨基酸序列中进一步包含额外的氨基酸序列，例如序列号:3的21个氨基酸序列。
[0023]另外，在本专利技术中，可以利用具有相同功效的片段代替本专利技术的A型肉毒毒素轻链蛋白。例如，作为这种片段，可以利用包含序列号:2的425个氨基酸序列的A型肉毒毒素轻链蛋白片段。在本公开的一个方面，本专利技术的A型肉毒毒素轻链蛋白片段由序列号:2的序列组成。
[0024]在本公开的一个方面，A型肉毒毒素轻链蛋白片段除了片段的氨基酸序列之外，还可以包含额外的氨基酸序列，用于生产蛋白质、纯化蛋白质等目的。例如，本公开的一个方面的A型肉毒毒素轻链蛋白片段可以在序列号:2的氨基酸序列中进一步包含额外的氨基酸序列，例如序列号:3的21个氨基酸序列。
[0025]然而，即使进一步包含额外的氨基酸序列，A型肉毒毒素轻链蛋白或其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其是包含A型肉毒毒素轻链蛋白或其片段作为有效成分并且附加地包含稳定剂的组合物，其中上述稳定剂是糖醇(Sugar alcohol)。2.如权利要求1所述的组合物，其中，上述稳定剂是碳数为2至6的糖醇。3.如权利要求1所述的组合物，其中，上述稳定剂是在20℃水中的溶解度为150mg/mL至10,000mg/mL的糖醇。4.如权利要求1所述的组合物，其中，上述稳定剂是碳数为2至6且在20℃水中的溶解度为150mg/mL至10,000mg/mL的糖醇。5.如权利要求1所述的组合物，其中，上述稳定剂是乙二醇(Ethylene glycol)、甘油(Glycerol)、赤藓糖醇(Er...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴智叡，安秉俊，千惠娟，
申请(专利权)人：株式会社LG生活健康，
类型：发明
国别省市：