本发明专利技术公开了一种苯丙氨酸解氨酶、编码基因及其应用，涉及生物医药技术领域。如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶具有较强的降解苯丙氨酸能力，相比来源于发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的stlA基因编码的苯丙氨酸解氨酶(PAL)，其降解苯丙氨酸的能力提高大约2.55倍。本发明专利技术为构建有效地降解苯丙氨酸的工程益生菌提供了更多的选择。本发明专利技术为治疗苯丙酮尿症提供新的选择。为治疗苯丙酮尿症提供新的选择。为治疗苯丙酮尿症提供新的选择。
【技术实现步骤摘要】
一种苯丙氨酸解氨酶、编码基因及其应用
[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种苯丙氨酸解氨酶、编码基因及其应用。
技术介绍
[0002]苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病,为常染色体隐性疾病，其特征是苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)编码基因缺陷,导致不能正常代谢苯丙氨酸(Phe)，使其在血液和大脑中积累，引发神经毒性。在中国，PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000，PKU患儿出生若不及时诊治，将会出现高苯丙酸血症，严重影响患儿的智力发育，引起癫痫和运动障碍等症状，并伴随黑色素合成障碍[1]。
[0003]苯丙氨酸的饮食限制一直是治疗PKU的主要手段。苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，主要从食物中获取。但PKU患儿不能完全不摄入苯丙氨酸，所以为了保证机体的正常生长发育，需要对PKU患儿采取低苯丙氨酸饮食来治疗，然而，低水平的饮食蛋白质会导致发育不良，许多患者无法终身坚持且带来严重经济负担等问题[2]。
[0004]除了控制饮食，盐酸沙丙蝶呤(KUVAN，生物菌素制药)和哌戊酶(帕林齐克，生物菌素制药)已被批准用于PKU的治疗药物。四氢生物蝶呤(BH4)是PAH的辅助因子，盐酸沙丙蝶呤是人工合成的BH4，可恢复PAH的活性，显著降低PKU患者的苯丙氨酸浓度，并可能放宽饮食限制。然而，大约只有三分之一到一半的患者对口服沙丙喋呤有反应[3]。因此，2018年FDA批准的一种新型治疗性聚乙二醇化苯丙氨酸解氨酶(PAL)受到了PKU患者的欢迎，并极大地改变了PKU患者的生活。此治疗方式可将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，从而降低苯丙氨酸含量，但可导致严重的不良反应和过敏反应[4,5]。
[0005]科学家也在尝试基因治疗，将携带表达人源PAH基因的cDNA重组腺病毒置于缺乏PAH的小鼠模型中，以恢复肝脏PAH活性，但还没有建立有效的体内基因转移载体。逆转录病毒载体在体外有效，但在体内转导效率较低。同样，DNA/蛋白质复合物在体内也没有被有效地表达。重组腺病毒载体，虽然在短期内完全成功，但由于对腺病毒载体的免疫反应，不能持续超过几周[6]。因此，寻找治疗PKU的新方法显得尤为必要。
[0006]苯丙氨酸解氨酶(PAL；EC 4.3.1.5PAL)是一种不需要辅助因子的强大酶，可以将苯丙氨酸转化为一种无害的代谢物反式肉桂酸。有研究表明植物来源的苯丙氨酸解氨酶(PAL；EC 4.3.1.5)在肠道中存活时间较长，可消耗食物中的苯丙氨酸，从而减少餐后血液中苯丙氨酸含量的上升。而且，已有初步研究表明，它在治疗PKU中具有一定的作用[7]。
[0007]肠道微生物群提供了一个机会，通过产生营养物质或降解其他可能有毒的膳食产品来调节宿主的代谢。研究人员报道，口服表达PAL的大肠杆菌伊氏乳杆菌后PKU(Pahenu2/enu2)小鼠模型中血液中Phe水平降低，这表明细菌传递的PAL有作为治疗PKU的潜力。到目前为止，有部分研究设计了工程菌株整合了来源于发光分枝杆菌(Photorhabdus luminescens)的苯丙氨酸解氨酶(stlA)的基因，表达苯丙氨酸解氨酶来实现降解苯丙氨
酸，这些工程菌株已有部分进展到人类临床研究[8]。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
[0009]本专利技术的目的在于提供一种苯丙氨酸解氨酶、编码基因及其应用以解决苯丙氨酸降解的难题，并为治疗苯丙酮尿症提供良好的工程菌基础。
[0010]本专利技术是这样实现的：
[0011]第一方面，本专利技术提供了一种苯丙氨酸解氨酶，其具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
[0012]其编码基因来源于多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)变种的Avpal
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C503S
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C565S，经过筛选，专利技术人发现：具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶具有较强的降解苯丙氨酸能力，与来源于发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的stlA基因编码的苯丙氨酸解氨酶(PAL)相比，其降解苯丙氨酸的能力提高大约2.55倍。本专利技术为构建有效地降解苯丙氨酸的工程益生菌提供了更多的选择。
[0013]植物来源的苯丙氨酸解氨酶具有肠道存活时间长的优势，能有效减少血液中苯丙氨酸含量，因此具有良好的治疗苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)的应用前景。
[0014]第二方面，一种苯丙氨酸解氨酶的编码基因，其编码上述的苯丙氨酸解氨酶；例如其具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
[0015]在本专利技术提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得苯丙氨酸解氨酶的核苷酸序列。
[0016]第三方面，本专利技术还提供了一种重组载体，其包括上述的苯丙氨酸解氨酶的编码基因。
[0017]例如利用重组酶将苯丙氨酸解氨酶的编码基因与pET28a载体重组。
[0018]第四方面，本专利技术还提供了一种重组菌，其包括上述的苯丙氨酸解氨酶的编码基因或上述的重组载体。
[0019]在一种可选的实施方式中，重组菌为工程益生菌。
[0020]在一种可选的实施方式中，重组菌为大肠杆菌、酵母菌等。
[0021]第五方面，本专利技术还提供了一种苯丙氨酸解氨酶或重组菌在如下任意一项中的应用：
[0022](1)制备治疗苯丙酮尿症的药物；
[0023](2)制备食品；
[0024](3)降解苯丙氨酸；
[0025](4)制备苯丙氨酸降解剂。
[0026]实验证明，本专利技术提供的重组菌体外具有显著的降解苯丙氨酸的能力，有望用于治疗苯丙酮尿症。
[0027]第六方面，本专利技术还提供了一种治疗苯丙酮尿症的药物，其包括苯丙氨酸解氨酶或重组菌。
[0028]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述药物还包括药学可接受的添加剂或辅料。
[0029]药学可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩
解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的一种或多种组合。
[0030]药学可接受的添加剂选自以下组成的组：赋形剂、稀释剂、粘合剂、成粒剂、助流剂、流动助剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂、包衣剂和甜味剂。
[0031]在一种可选的实施方式中，药物剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。
[0032]第七方面，本专利技术还提供了一种药物组合物，其包括上述的药物。
[0033]在一种可选的实施方式中，药物组合物还包括联用药物，联用药物选自化学药物。
[0034]例如选自能降低哺乳动物血苯丙氨酸的含量的药物，选自：BH4、LNAA、或其组合。例如与其他有类似功能的药物同时使用。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸解氨酶，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。2.一种苯丙氨酸解氨酶的编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶；优选地，其具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。3.一种重组载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的苯丙氨酸解氨酶的编码基因。4.一种重组菌，其特征在于，其包括权利要求2所述的苯丙氨酸解氨酶的编码基因或权利要求3所述的重组载体；优选地，所述重组菌为工程益生菌；优选地，所述重组菌为大肠杆菌。5.一种如权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶或权利要求4所述的重组菌在如下任意一项中的应用：(1)制备治疗苯丙酮尿症的药物；(2)制备食品；(3)降解苯丙氨酸；(4)制备苯丙氨酸降解剂。6...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱永亮，任倩，
申请(专利权)人：苏州普瑞森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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