测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用。本发明专利技术基于液相色谱

【技术实现步骤摘要】
测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物化学检测
，具体涉及一种测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用。

技术介绍

[0002]血红蛋白病包括地中海贫血和异常血红蛋白病。地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，是我国儿童的常见疾病，约占所有贫血的30
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40％，广泛分布于世界多个地区，在我国，尤其以重庆、四川、广东、广西等省市多见，是非常值得关注的社会问题。本病是由于遗传缺陷导致血红蛋白α、β珠蛋白链合成缺失或不足，α、β珠蛋白链比例失衡，进而造成红细胞寿命缩短或功能异常的一种先天性贫血。地中海贫血根据异常表达的珠蛋白链的不同，主要分为α地中海贫血和β地中海贫血两大类。异常血红蛋白病主要由珠蛋白链单个氨基酸的置换变异引起，常见类型有HbC、HbE、HbS，其中HbE又称为镰状细胞贫血，是中国人群最常见的一种。
[0003]作为发病后的诊断，一般通过血常规检查发现为低色素性小细胞贫血。排除缺铁性贫血，结合血红蛋白电泳与基因诊断技术对疑似珠蛋白生成障碍性贫血的病人进行确诊，实验操作复杂，诊断费用昂贵，且不利于筛查普及。目前已有报道利用毛细管电泳对血红蛋白病进行早期筛查，但该方法对样本采样及保存要求高，筛查灵敏度和特异度有限，且常因样本溶血、降解、保存不当以及年龄等因素，造成无法检测，甚至漏筛、漏诊等情况，其临床应用受到限制。目前对血红蛋白病尚缺乏快速、高效的筛查手段。本专利通过研究发现，a、β、ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病存在密切联系，通过检测各型珠蛋白链，可识别出各年龄段血红蛋白病患者的疾病类型。
[0004]申请号为CN201510618319.5的专利技术专利公开了一种测定血红蛋白α与β珠蛋白链比率的方法及应用，但并未公开ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病之间的联系，也未公开ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链的定性定量分析方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的之一在于提供一种血红蛋白病的标志物组合物，该标志物组合物可早期识别不同类型的血红蛋白病。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]血红蛋白病的标志物组合物，所述标志物组合物由血红蛋白中的a珠蛋白链、β珠蛋白链、ζ珠蛋白链、δ珠蛋白链、γ珠蛋白链、ε珠蛋白链中的任两种或多种组成；所述血红蛋白来源于血红蛋白病患者的离体样本；所述血红蛋白病包括地中海贫血和异常血红蛋白病，所述地中海贫血包括a地中海贫血和/或β地中海贫血，所述异常血红蛋白病包括异常血红蛋白病HbC、异常血红蛋白病HbS和/或异常血红蛋白病HbE。
[0008]a、β、ζ、δ、γ、ε珠蛋白链在人体内的表达具有时间特征，不同类型血红蛋白病累及的珠蛋白链不同，一种类型珠蛋白链表达减少时常伴随其它同类型珠蛋白链表达增加，通
过液相色谱
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质谱技术定性、定量分析受累的珠蛋白链，计算其与其它正常表达珠蛋白链的比率，可实现各型地中海贫血及异常血红蛋白病的鉴别。各型血红蛋白病的鉴别诊断指标为：
[0009][0010][0011]正常人、α地中海贫血携带者及患者ζ/α比值参考区间为：
[0012][0013]正常人、β地中海贫血携带者、患者γ/β、δ/β比值参考区间为：
[0014][0015][0016]正常人、异常血红蛋白病携带者、患者标志肽段/珠蛋白链浓度参考区间为：
[0017][0018]进一步，所述标志物组合物为α珠蛋白链和X1，其中X1为β珠蛋白链、γ珠蛋白链、δ珠蛋白链或ζ珠蛋白链；或所述标志物组合物为β珠蛋白链和X2，其中X2为γ珠蛋白链、δ珠蛋白链、ζ珠蛋白链或ε珠蛋白链；或所述标志物组合物为ζ珠蛋白链和γ珠蛋白链。
[0019]进一步，所述血红蛋白中各型珠蛋白链经不同蛋白酶消化而产生的肽段片段均可作为对应珠蛋白链的标志物。
[0020]不同蛋白酶(胰蛋白酶、羧肽酶、纤溶酶、凝血酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶等)裂解各型珠蛋白链产生的肽段片段会有所不同，然而不论采用上述何种蛋白酶裂解珠蛋白链，其产生的肽段片段均可作为血红蛋白分析的标志物：α珠蛋白链裂解片段均可作为α珠蛋白链的标志肽段；β珠蛋白链裂解片段均可作为β珠蛋白链的标志肽段；ζ珠蛋白链裂解片段均可作为ζ珠蛋白链的标志肽段；δ珠蛋白链裂解片段均可作为δ珠蛋白链的标志肽段；γ珠蛋白链裂解片段均可作为γ珠蛋白链的标志肽段；ε珠蛋白链裂解片段均可作为ε珠蛋白链的标志肽段。这些标志肽段均可用于诊断指标设计。
[0021]进一步，所述α珠蛋白链肽段标志物为α珠蛋白链特征肽段αT1～αT14中的任一种或多种，所述α珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：1
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14；
[0022]或所述β珠蛋白链肽段标志物为β珠蛋白链特征肽段βT1～βT15中的任一种或多种，所述β珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：15
‑
29；
[0023]或所述ζ珠蛋白链肽段标志物为ζ珠蛋白链特征肽段ζT1～ζT15中的任一种或多种，所述ζ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：30
‑
44；
[0024]或所述δ珠蛋白链肽段标志物为δ珠蛋白链特征肽段δT1～δT16中的任一种或多种，所述δ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：45
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60；
[0025]或所述γ珠蛋白链肽段标志物为γ珠蛋白链特征肽段γ
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T1～γ
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T14、γA
‑
T15、γ
‑
T16中的任一种或多种，所述γ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：61
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76；
[0026]或所述ε珠蛋白链肽段标志物为ε珠蛋白链特征肽段εT1～εT16中的任一种或多种，所述ε珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：77
‑
92。
[0027]以上特征肽段均由胰蛋白酶裂解各型珠蛋白链而产生。
[0028]进一步，所述a地中海贫血标志物组合物有3种，分别为ζ珠蛋白链和α珠蛋白链，ζ珠蛋白链和γ珠蛋白链，ζ珠蛋白链和β珠蛋白链；
[0029]所述β地中海贫血标志物组合物有5种，分别为α珠蛋白链和γ珠蛋白链，γ珠蛋白链和β珠蛋白链，ε珠蛋白链和β珠蛋白链，δ珠蛋白链和α珠蛋白链，δ珠蛋白链和β珠蛋白链；
[0030]所述异常血红蛋白病HbC的标志物组合物有3种，分别为βCT1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，βCT1珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，βCT1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链；
[0031]所述异常血红蛋白病HbS的标志物组合物有3种，分别为βST1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，βST1珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，βST1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链；
[0032]所述异常血红蛋白病HbE标志物组合物有3种，分别为βET3珠蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的分离方法，其特征在于，所述各型珠蛋白链包括a珠蛋白链、β珠蛋白链、ζ珠蛋白链、δ珠蛋白链、γ珠蛋白链和/或ε珠蛋白链；所述血红蛋白来源于血红蛋白病患者；所述分离方法为：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段进行分离；所述流动相A为含有甲酸的去离子水，流动相B含有甲酸的乙腈溶液；所述梯度洗脱程序为：时间(min)流速(ml/min)流动相A(％)流动相B(％)0.000RUN
‑‑
0.0000.42093.07.00.3000.42090.010.01.2000.42070.030.01.5000.4206.094.02.5000.4205.095.02.5000.4207.07.03.500Stop Run
‑‑
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：S1：取所述血红蛋白病患者的血液样本进行前处理，萃取裂解得到含有所述各型珠蛋白链裂解片段的待测样本；S2：配置标准溶液；S3：将S2所得标准溶液、S1所得待测样本进样，进行梯度洗脱，分离得到所述各型珠蛋白链的特征肽段。3.根据权利要求2所述的分离方法，所述血液样本为外周血、末梢血、足跟血中的任一种或多种。4.定性、定量检测血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：S1：采用权利要求1
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3所述的方法分离出血红蛋白中所述各型珠蛋白链的特征肽段；S2：在电喷雾电离阳离子检测模式下，采用SRM/PRM/MRM模式采集数据，得到所述各型珠蛋白链特征肽段的液相色谱
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质谱鉴定图谱，碎片离子组成；S3：将S2所得数据进行转换，得到特异离子对与内标的比值数据；S4：将S3获取的特异离子对和内标的峰面积比值数据，与特异离子对的标准浓度进行线性分析，制备标准曲线，得到所述各型珠蛋白链特征肽段的含量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，定性、定量检测时，所述各型珠蛋白链标志肽段不同的碎片离子对组合均可用于样本检测。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述质谱仪离子源参数为：鞘气流速为40psi，辅助气流速为18arb，喷雾电流为1.7uA，喷雾电压为3.0KV，离子传输管温度为320℃，S
‑
lens视频水平为50，辅助气加热温度为400℃。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据所述方法得出各型珠蛋白链标志肽段的含量计算公式如下：a珠蛋白链标志肽段αT3：Y1＝3.608e
‑4X1‑
3.508e
‑2；或β珠蛋白链标志肽段βT2：Y2＝6.513e
‑4X2+6.518e
‑3；
或ζ珠蛋白链标志肽段ζT8：Y3＝1.165e
‑2X3+3.033e
‑2；或δ珠蛋白链标志肽段δT2：Y4＝1.53e
‑2X4+1.41e
‑2；或γ珠蛋白链标志肽段γT10：Y5＝3.245e
‑2X5‑
1.009e
‑1；上述公式中Y表示各型珠蛋白链标志肽段特异离子对与内标的...

【专利技术属性】
技术研发人员：余朝文，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：