基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒及使用方法，涉及基因检测技术领域。该试剂盒基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2的基因突变的试剂盒，包括基于多重PCR扩增检测BRCA1/2突变外显子序列的引物。多重PCR为较大片段的基因扩增提供可行性，在同一反应体系里加入混合的多对引物进而扩增出多个核酸片段，能够在同一反应管中实现多基因片段同时进行检测，在提高通量的同时节省样本降低成本，简便，快速，节省时间。本发明专利技术通过设计多对引物实现在同一PCR反应体系中同时扩增出多个片段的PCR反应，成功避开设计探针、芯片等高成本元素，实现一步制备BRCA1/2基因突变测序文库，具有高效、系统、经济、简便的优势。简便的优势。

【技术实现步骤摘要】
基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其是涉及一种基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒及使用方法。

技术介绍

[0002]近年来，我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，尤其在许多大中城市中，乳腺癌已居女性恶性肿瘤的首位，而且发病年龄也越来越趋于年轻化。在我国所有乳腺癌患者中，约有10％的乳腺癌属于家族性乳腺癌，家族性乳腺癌是指乳腺癌在家系中呈聚集样发生，一般指家族中一级及二级亲属至少有2个或2个以上患有原发性乳腺癌和/或卵巢癌患者。乳腺癌的发生与发展是一个复杂的生物学过程，涉及遗传性因素与非遗传性因素及二者的相互作用。
[0003]BRCA1/2基因是目前发现的与家族性乳腺癌发病关系最为密切的两个基因。BRCA基因又称乳腺癌易感基因，是肿瘤抑制基因，在细胞生长、增殖、分化过程中发挥负性调控作用。人类BRCA1、BRCA2基因分别定位于人类染色体17q21、13q12.3，其表达的蛋白在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥重要作用。现有研究表明，携带胚系BRCA1/2突变可使女性患乳腺癌的风险较正常人群增加约5倍，并可显著增加患卵巢癌、胰腺癌等其他相关癌症的风险。当个体携带BRCA1/2突变基因时，终身患乳腺癌的风险将大大增加。在原发性乳腺癌中，普通人患病风险约占12％，而BRCA1基因突变的人群患病风险约增加至46％
‑
87％，BRCA2基因突变的人群患病风险约增加至38％
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84％。
[0004]BRCA1/2基因的遗传方式属于常染色体显性遗传，BRCA1/2基因突变属于胚系突变，具有遗传倾向。目前发现BRCA1突变位点以5号外显子、11号外显子、18号外显子、21号外显子为多见，BRCA2突变主要集中在在10号外显子和11号外显子上。北京大学肿瘤医院乳腺中心(家族遗传性肿瘤中心)发表的研究分析了各类乳腺癌患者的BRCA1/2基因突变携带率，结果如下：整体乳腺癌人群，5.3％；有乳腺癌和或卵巢癌家族史的患者，18.1％；≤40岁发病的患者，6.4％；散发乳腺癌(无乳腺癌和或卵巢癌家族史)，3.3％；ER+和或PR+、HER2
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的乳腺癌，5.4％；ER+和或PR+、HER2+的乳腺癌，2.7％；ER
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、PR
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、HER2
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的乳腺癌，1.8％；ER
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、PR
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、HER2
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(三阴乳腺癌)，11.2％。BRCA1和BRCA2基因可发生多形式多位点的基因突变。
[0005]BRCA1/2基因突变的检测结果将为后期的更好的治疗、遗传阻断、相关肿瘤的早诊和预防提供重要的指导。2020年的NCCN指南建议乳腺癌患者进行BRCA1/2基因检测的标准如下：≤45岁时确诊为乳腺癌；患者本人或近亲属中在任何年龄发现2个或以上乳腺原发癌(如双侧乳腺癌，同侧≥2个独立的乳腺原发癌，同时或异时时发生)；家族成员中有在46～50岁之间诊断为癌症，或在任何年龄再次诊断为乳腺癌，或≥1个近亲属在任何年龄诊断为乳腺癌，或≥1个近亲属诊断为高级别前列腺癌(Gleason评分≥7分)；≤60岁被诊断为三阴性乳腺癌的患者；≥1个近亲属在任何年龄被诊断为卵巢癌(包括输卵管癌和原发性腹膜
癌)、转移性前列腺癌、胰腺癌；有任何年龄患乳腺癌的男性亲属。对于符合NCCN指南检测标准的患者，应当积极完善BRCA1/2基因检测，不符合检测标准的患者，如果经济条件尚可，也建议进行BRCA1/2。通过对BRCA1/2基因突变的检测，可以筛选出乳腺癌高危人群、明确家族中有无相关基因突变、评估易感人群乳腺癌发生几率。
[0006]目前常用的BRCA1/2突变检测方法有：变性高效液相色谱分析技术(DHPLC)、单链构象多态性检测(SSCP)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、蛋白质截断测试(PTT)、高分辨率溶解曲线(HRM)、一代测序以及高通量测序等。DHPLC与HRM不能准确检测出具体的突变类型；SSCP与PPT的缺点是检测灵敏低；MLPA只能用于检测已知突变，不能检测其他未知突变；一代测序成本高，不能检测大片段缺失重排，需联合MLPA使用。而二代测序具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化以及可检测多种突变类型等优点。目前临床方面常见的各类基因检测均存在二代测序技术的参与，并基本能实现检测的高通量性，然而全基因组或全外显子测序及测序芯片的成本均较高，存在检测成本高，工作量大、检测周期较长等缺点，不能广泛应用于有需求的患者，不利于检测的推广，仍需要进一步的改善。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在缺陷与不足，本专利技术的目的是提供一种特异性高、灵敏度高、周期短和成本低的基于多重PCR建库二代测序乳腺癌的BRCA1及BRCA2基因突变检测方法。
[0008]本专利技术的第一方面在于公开基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述引物为针对BRCA1基因的第5、11、18、21号外显子和BRCA2基因的第10、11号外显子来设计特异性扩增基因热点突变位点区域的上下游引物。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测所述BRCA1基因第5号外显子的上游引物序列：GACTTCTACAGAGTGAACC；下游引物序列：GGTTCACTCTGTAGAAGTCTT。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测所述BRCA1基因第11号外显子的上游引物序列：GCTGAACTAGAAGCTGTGTTAGAAC；下游引物序列：GTTAGAAGGCTGGCTCCCATGCTGT。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测所述BRCA1基因第18号外显子的上游引物序列：TTGAAGTCAGAGGAGATGTGGTC；下游引物序列：GACCTTGGTGGTTTCTTCCATTGAC。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测所述BRCA1基因第21号外显子的上游引物序列：CAGATGCCTGGACAGAGGACAATGG；下游引物序列：GCCATTGTCCTCTGTCCAGGCATCT。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测所述BRCA2基因第10号外显子的上游引物序列：GCCAAATGTCCTAGAAGATGAAGTA；下游引物序列：TCTTCTAGGACATTTGGCATTGACT。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，用于检测BRCA2基因第11号外显子的上游引物序列：CATGAGAGTAGCATCACCTTCAAGA；下游引物序列：TTGAATGTTGTACTGGGTGACATG。
[0016]本专利技术的第二方面在于公开一种基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2的基因突变的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1BRCA2基因突变的试剂盒，其特征在于，包括基于多重PCR扩增检测BRCA1/2突变外显子序列的引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为针对BRCA1基因的第5、11、18、21号外显子和BRCA2基因的第10、11号外显子来设计特异性扩增基因热点突变位点区域的上下游引物。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第5号外显子的上游引物序列：GACTTCTACAGAGTGAACC；下游引物序列：GGTTCACTCTGTAGAAGTCTT。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第11号外显子的上游引物序列：GCTGAACTAGAAGCTGTGTTAGAAC；下游引物序列：GTTAGAAGGCTGGCTCCCATGCTGT。5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第18号外显子的上游引物序列：TTGAAGTCAGAGGAGATGTGGTC；下游引物序列：GACCTTGGTGGTTTCTTCCATTGAC。6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA1基因第21号外显子的上游引物序列：CAGATGCCTGGACAGAGGACAATGG；下游引物序列：GCCATTGTCCTCTGTCCAGGCATCT。7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测所述BRCA2基因第10号外显子的上游引物序列：GCCAAATGTCCTAGAAGATGAAGTA；下游引物序列：TCTTCTAGGACATTTGGCATTGACT。8.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测BRCA2基因第11号外显子的上游引物序列：CATGAGAGTAGCATCACCTTCAAGA；下游引物序列：TTGAATGTTGTACTGGGTGACATG。9.基于多重PCR联合NGS检测乳腺癌BRCA1B...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵保兵，张晶鑫，高丹丹，王智凤，
申请(专利权)人：江苏康极生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：