基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法及试剂盒，其中检测方法包括通过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建、测序文库的纯化、测序和结果分析步骤，试剂盒内包括特异性引物对（引物混合液）、EGFR特异性扩增引物、10

【技术实现步骤摘要】
基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]人类表皮生长因子受体家族（Epidermal Growth Factor Receptor Family，EGFR家族）是酪氨酸激酶受体ErbB家族跨膜糖蛋白成员，可以作为细胞表面蛋白与表皮生长因子发挥作用。EGFR与其配体的结合会诱导其受体酪氨酸激酶的自磷酸化和二聚化，持续激活后续信号转导通路的活化过程。从而参与癌细胞的增殖、存活、迁移和分化等过程。大量研究表明，靶向EGFR的抑制剂（TKI）是现有晚期非小细胞肺癌重要的治疗方式之一。
[0003]美国国家综合癌症网络（NCCN）提出：EGFR突变与靶向EGFR的抑制剂治疗的反应性有关，其中外显子19（Exon 19）缺失及Exon 21中L858R位点突变是最常见的与TKI相关的突变形式。另外也存在一些不常见的突变：Exon 21中L861Q，Exon 18中G719X，Exon 20中S768I。这些约占总突变的10%。Exon 20中T790M也是最常见的一种突变，NCCN强调T790M为主要耐药机制的第一代或第二代TKI进展患者中。Exon 20突变是一组不同的框内重复或插入突变，不同位置上碱基的变化与TKI治疗缺乏、药物敏感性等相关，常常需要进行额外的检测来进一步阐明EGFR Exon20插入。
[0004]随着测序技术的不断完善，EGFR中越来越多的突变被发现，但大多数突变与临床肺癌的相关性尚未明确。qRT
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PCR、Sanger测序（一代测序技术）和二代测序技术（Next Generation Seqence，NGS）为现有针对EGFR突变的主要检测方式。但PCR通量低，且测序过程的成本过高常常影响临床检测及实验的进程及应用的普及。
[0005]现有产品多为基于qRT
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PCR的EGFR单基因检测试剂盒。这些试剂盒多是针对EGFR热点突变位点的检测。其缺点为价格高、敏感度低，并且在样本制备及测序时，常常会发生碱基突变这导致其结果的不完全可信。
[0006]多重聚合酶链式反应（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）也称多重PCR，是在普通PCR的基础上演变而来。多重PCR是指在进行PCR时，体系中含有两对及两对以上的引物，可以同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，并对多个序列进行检测，达到一举多得。相较于传统技术单重PCR，它更为高效、操作简便、灵敏度高、经济实惠。目前，多重PCR检测技术应用范围广泛，如细菌毒力基因、耐药基因、植物细菌病毒以及食品种类等。多重PCR检测与其他检测方式的联合，可以进一步的完善现有检测方式，大大提升检测效率。NGS又称高通量测序技术，涵盖了全基因组、外显子和基因包测序等，通过核酸提取、建库、扩增、目标序列捕获、测序及生物信息学分析等过程获得DNA序列，从而对临床诊断及治疗过程具有重要的价值。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术设计了一种基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方
法及试剂盒，操作简单，只需1次扩增及1次纯化过程，本专利技术基于多重PCR与二代测序技术的联合，可以对低浓度样本进行特异性识别，检测灵敏度高且检测特异性高。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法，包括如下步骤：通过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建、测序文库的纯化、测序和结果分析；其中，EGFR突变位点包括EGFR基因A289V位点、R521K位点、G598V位点、G719X位点、S768I位点、T790M位点、L858R位点、L861Q位点、19Del位点及20Ins位点。
[0009]作为本专利技术基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法的进一步改进：通过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建的构建方法包括，1）、提取：提取基因组样本中基因组，并对对提取后的产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察条带大小和纯度情况；2）、预处理：通过Qubit 4荧光计测定基因组提取后的浓度，保持其制备浓度为10 ng/μL，检测成功得到多重PCR模板得到多重PCR模板；3）、制样：将为多重PCR模板与2
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Taq 酶、引物混合液混合，并由ddH2O将混合物补足至40 μL；4）、PCR扩增：将混合物放置于PCR仪上扩增，并在98℃下进行预变性5min、95℃下变性30sec、60℃下退火30sec、72℃下延伸30sec、72℃下终延伸2min，并在4℃下保温；5）后处理：将反应后PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察条带大小和纯度情况，同时通过Qubit 4荧光计测定构建的文库片段的浓度。
[0010]作为本专利技术基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法的进一步改进：基因组样本来源于血浆、血清、血液、尿液、汗液、唾液、精液、胸水、腹水、粪便、穿刺样本和石蜡包埋组织切片样本中的至少一种。
[0011]作为本专利技术基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法的进一步改进：所述测序文库的纯化包括如下步骤，a)向含有扩增产物的PCR管中加入30μL提前平衡至室温的纯化磁珠，混合均匀，25℃孵育5min；b)将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清；c)沿离心管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30sec，使用移液器移弃上清；d)重复以上步骤一次；e)离心管置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇；f)将磁珠置于室温干燥2
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5min，至乙醇挥发完全；g)移出PCR管，向PCR管中加入21μL TE Solution，将磁珠悬浮混匀，25℃孵育5min；h)将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清，使用移液器小心吸取20μL上清转移至一个新的0.2mL PCR管中保存；I)通过Qubit 4荧光计及2%琼脂糖凝胶对文库进行浓度、纯度及片段长度的测量。
[0012]作为本专利技术基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法的进一步改进：所述测
序通过Illumina 二代测序仪进行测序分析；所述结果分析是通过生物信息学进行比较分析，具体操作步骤如下：Ⅰ）、将测序结果与参考基因序列比对，并寻找SNP和Indel；Ⅱ）、运用ANNOVAR软件对SNP、Indel位点进行注释、确定突变位点对应的基因信息。
[0013]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：所述的基于多重聚合酶链式反应联合二代测序的EGFR突变检测试剂盒，包括检测EGFR A289V位点、EGFR R521K位点、EGFR G598V位点、EGFR L858R位点、EGFR L861Q位点、EGFR G719X位点、EGFR S768I位点、EGFR T790M位点、EGFR 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：通过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建、测序文库的纯化、测序和结果分析；其中，EGFR突变位点包括EGFR基因A289V位点、R521K位点、G598V位点、G719X位点、S768I位点、T790M位点、L858R位点、L861Q位点、19Del位点及20Ins位点。2.如权利要求1所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法，其特征在于：通过多重PCR对EGFR基因进行NGS文库构建的构建方法包括，1）、提取：提取基因组样本中基因组，并对对提取后的产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察条带大小和纯度情况；2）、预处理：通过Qubit 4荧光计测定基因组提取后的浓度，保持其制备浓度为10 ng/μL，检测成功得到多重PCR模板；3）、制样：将为多重PCR模板与2
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Taq 酶、引物混合液混合，并由ddH2O将混合物补足至40 μL；4）、PCR扩增：将混合物放置于PCR仪上扩增，并在98℃下进行预变性5min、95℃下变性30sec、60℃下退火30sec、72℃下延伸30sec、72℃下终延伸2min，并在4℃下保温；5）后处理：将反应后PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳，观察条带大小和纯度情况，同时通过Qubit 4荧光计测定构建的文库片段的浓度。3.如权利要求2所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法其特征在于：基因组样本来源于血浆、血清、血液、尿液、汗液、唾液、精液、胸水、腹水、粪便、穿刺样本和石蜡包埋组织切片样本中的至少一种。4.如权利要求1所述的基于多重聚合酶链式反应的EGFR突变检测方法其特征在于：所述测序文库的纯化包括如下步骤，a)向含有扩增产物的PCR管中加入30μL提前平衡至室温的纯化磁珠，混合均匀，25℃孵育5min；b)将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5min至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清；c)沿离心管壁缓慢加入20...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵保兵，张晶鑫，高丹丹，王智凤，
申请(专利权)人：江苏康极生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：